Способ диагностики гепатита Советский патент 1985 года по МПК G01N33/49 A61B10/00 

00

о

Од Изобретение относится к медицине и ка сается способа диагностики гепатита. Известен способ дифференциальной диагностики хронического активного гепатита р стадии ремиссии и хронического персистирующего генатита 1 . Однако диагностика затруднена из-за сходства клинике-биохимических и морфологических проявлений болезни. Известен способ диагностики гепатита, заключающийся в том, что смешивают кровь больного с антикоагулянтом, вьщеля ют лимфомоноцитарную смесь, подсчитывают клетки, прилипшие (фиксированные) на стекле 2. Однако известный метод обеспечивает ди агностику острого вирусного гепатита В и не отграничивает хронический персистирующий гепатит и хронический активный гепатит в период ремиссии. Целью изобретения является дифференциальная диагностика хронического персистирующего гепатита и хронического активного гепатита в период ремиссии. Указанная цель достигается тем, что согласно способу диагностики гепатита, включающему смешивание крови больного с антикоагулянтом, выделение клеток лиМфомоноцитарной смеси и подсчет из них фиксированных на стекле, лимфомоноцитарную смесь наносят на стекло в виде висячей капли, при этом смеси готовят на среде с 10% пулированной сьшоротки АВ группы крови и берут в концентрации 2,5x10 1СЧ/МЛ, h при показателе фиксированных клеток от 9 до 36% диагностируют хронический активный гепатит, а при показателе фиксированных клеток 1-8% хронический персистирующий гепатит. Способ осуществляют следующим образом У больного забирают 3 мл периферической крови в пробирку с 60 ед. гепарина. Лимфомоноцитарную взвесь, выделенную на градиенте плотности фиколл-верографина (1,077), разводят питательной средой 199, содержащей 10% пула инактивированных сывороток доноров IY/AB/ гругаты крови, до концентрации 2,5x10 клеток в 1 мл. Из капли взвеси делают мазок для подсчета процентного соотношения лимфодатов и моноцитов. По 0,01 мл указанной взвеси (2.5x10 к ток) автоматической пипеткой наносят на два квадрата площадью Р,25 см, выгравированных на предметном стекле (стекло тщательно обезжирено кипячением в растворе стирального порошка и дистиллированной воды и последующим содержанием в 96 спирте), инкубируют 1 ч при 37°С. 62 Затем стекло переворачивают для образования феномена висячей капли и в таком положении оставляют 20 мин при комнатной температуре. Неприлипшие клетки, сконцентрированные в висячей капле, удаляют полоской фильтровальной бумаги, которую осторожно прикладывают к краю квадрата. Затем 0,04 мл среды 199 с указанной сывороткой наносят на каждый квадрат для дополнительного отмьгаания неприлипших клеток. Жидкость сразу же отсасывают полоской фильтровальной бумаги. Препарат высушивают, фиксируют 5 мин метанолом и окрашивают по Романовскому-Гимзе. Дифференцированный подсчет лимфоцитов и моноцитов производят по всей площади квадрата при световой микроскопии (увеличение х 630). Процент прилипших клеток высчитывают по формуле: X 100%, 2500 где А - общее число прилипших по всей площади квадрата клеток; 2500 - число клеток, внесенных в квадПример расчета. Определяют процент прилипания клеток по формуле X 1Ш%, процент прилипания; где 0 количество прилиппшх клеток; количество клеток, использованных в реакции. Тогда при и М г 2500 А 908 АО 36,3%; при А, 225 и М 2500 Ajj 9% ри показателе процента прилипания 36, 3 и 9% у больного диагностируют хронический активный гепатит в стадии ремиссии); при А., 25 и М т 2500 Ар 1% при А 200 и М 2500 Ао 8% (при показателе процента прилипания 1 и 8% у &)льного диагносцируют хронический перотстирующий гепатит). Пример 1. Больная О., 19 лет, клинический диагноз - хронический активный гепатит (диагноз выставлен в 1977 г. на основании клинико-биохимических данных; слабость, желтушность, гепатоспленомегалия; АлАТ 6,25 моль; билирубин 2,5 мг%; тг-глобулины 42% и инструментальных методов исследования: скенировани и пункционная биопсия печени). На основании указанного больной была назначена терапия кортикостероидами, которую проводили до 1980 г. К январю 1980 г. достигнута клиникобиохимическая ремиссия (билирубин 0,4 мг% АлАТ 0,69 моль; г-глобулин 23%; жало нет). При пункционной биопсии печеш{ в . 1980г. - в препарате ткань печени .без признаков явной патологии. Предлагаемым способом диагностики определено высокое число прилипающих клеток (36,1%), на основании чего было диагностировано наличие хронического активного процесса в печени. При дальнейшем наблюдении за больной диагноз был подтвержден обострением процесса в августе 1981г. (билирубин 2,5 мг%; АлАТ 3,5 моль; -глобулины 32%). Больная находится на диспансерном набл дении. В течение 1981-1983 г. постоянно принимает поддерживающие дозы преднизолона из-за периодического повышения АлАТ Пример 2. Больная П., 58 лет, клинический диагноз - хронический актив ный гепатит, развивающийся после тя)(селой формы вирусного гепатита, перенесенного в 1978 г. Диагноз выставлен на основании клинико-биохимических данных и морфологического исследования печени. Больную лечили преднизолоном и к маю 1980 г. была достигнута клинико-биохимическая ремиссия (билирубин 0,7 мл%; АлАТ 0,13 . моль; у -глобулины 23%). Предлагаемым способом диагностики в этот период определено высокое число прилипающих клеток (9,0%) и диагностировано наличие хронического активного процесса в печени, что подтверждено результатом морфологического исследования (при пункционной биопсии печени в препарате выявлен перипортальный гепатит с переходом в цирроз печени) и дальнейшим наблюдением за больной: в сентябре 1981 г. больная поступила в клинику с тяжелым обострени ем процесса (билирубин 11,3 мл%; АлАТ 4,3 моль; -глобулины 43%). С этого времени находится на диспансерном наблюдении и поддерживающих дозах преднизолона (нестойкая ремиссия). Пример 3. Больной К., 47 лет. В 1979 г. перенес острый вирусный гепатит в средней тяжести. В дальнейшем сохранилось персистирование НЕ А при несколько повышенном содержании билирубина (1,8 мл% и активности АлАТ (1,29 моль). При исследовании предлагаемым методом число прилипающих клеток составило 1,1%, 064 на основании чего был выставлен диагноз: хронический персистирующий гепатит (исследование проведено 02.01.80). Позже диагноз подтвержден результатом морфологического исследования (при пункционной биопсии выявлен перипортальный гепатит, . хронический персистирующий гепатит). В течение последующих двух лет обострений заболевания отмечено не было, но при биохимическом исследовании в 1981 г. выявлено повышенное содержание АлАТ (1,68 моль) при нормальных значениях билирубина (0,7 мл%) и осадочных проб (сулемовая проба 80%; тимоловая 4,5 ЕД), что свидетельствует о наличии невыраженного воспалительного процесса в печеин благоприятного течения, при котором применение кортикостероидов не показано. Пример 4,- Больной Б., 25 лет. В октябре 1979 г. -перенес острый вирусный гепатит. В дальнейшем при клинико-биохими-: ческЬм наблюдении за больным постоянно выявляли некоторое повышение содержания билирубина крови (13.12.79 г. 2,5 мг%; 06.06.80 г. 1,2 мг%; 05.09.80 г. 2,1 мг%), а при морфологическом исследовании - в препарате картина портального гепатита. На основании указанных исследований больному выставлен диагноз - хронический персистирующий гепатит и с 1980 г. он находится на диспансерном учете. Предлагаемым способом диагностики 10.10.80 г. у больного в крови определено 8% прилипающих клеток, что подтверждает указанный диагноз и свидетельствует с благоприятном теченни заболевания. Таким образом, предложенный способ диагностики позволяет в 80-90% случаев достоверно дифференцировать хронический перснстирующий гепатит и хронический активный гепатит в стадии ремиссии. В процессе экспериментальной разработки способа выявлены следующие особенности. С помощью создания феномена висячая капля удается избавиться от неприпипших к стеклу клеток, не травмируя оставшиеся на стекле фиксированные (прилипшие) клетки. Прополаскивание или промьтание стекла приводит к нарушению целостности клеток и сопровождается невоспроизводамостью результатов. При создании феиомена висячая капля клетки, не прилипшие или слабо прилипшие к стеклу, в силу фязических свойств стекают в каплю и у11аляются фильтровальной бумагой, чем достигается максимальная стандартизация удаления клеток без нарушения их (Щ)уктуры и функции. В качестве среды для инкубации лнмфомоноцитарной смеси следует использовать

смесь питательной среды с 10% пулированной сыворотки крови доноров АВ (IV) группы. Использование физиологического ра.вора или фосфатного буфера вместо питательной среды для кратковременного культивирования приводит к снижению жизнеспособности клеток. Необходимо использовать пулированную сыворотку крови здоровых доноров АВ (IV) группы крови, так как применеиие аутологичной сыворртки неадекватио из-за наличия в ией блокируюиЫх факторов при хронических заболеваниях печени.

Для нанесения на стекло целесообразно использовать концентрацию клеток 2,5 х х10 в .1 мл (2500 клеток иа пробу).

При использовании менее ,2000 клеток на пробу в случаях низкого процента прилипания на стекле оставались единичные клетки, что затрудияло оценку реакции. При использоваиии более ЗООО клеток на пробу в случаях высокого процента прилипания подсчет прилипших клеток был затруднен из-за большого их числа и образования конгломератов, что ухудшало воспроизводимость результатов.

с

Предлагаемый способ позволяет достоверно (в 80-90% сл.учаев) дифференцировать хронический персистирующий гепатит и хронический актнвнЬш гепатнт в стадии ремиссии.

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ГЕПАТИТА путем смешивания крови больного с антикоагулянтом, выделения клеток лимфомоноцитарной смеси и подсчета из них фиксированных на стекле, отличающ и и с я тем, что, с целью дифференциальной диагностики хронического персистирующего и хронического активного гепатита в период ремиссю, лимфомоноцитарную смесь наносят на стекло в виде висячей капли, при этом смесь готовят на среде с 10% пулированной сыворотки АВ группы крови и берут в концентрации 2, кл/мп, и при показателе фиксированных клеток от 9 до 36% диагностируют хронический активиый гепатит, а при показателе фиксированных клеток от 1 до 8% - хроцический персистирующий гепатит.