Способ определения биологической активности химических соединений Советский патент 1985 года по МПК G01N33/48 

4

:

QD 00 изобретение относится к фармакологии и может быть использовано для первичной оценки биологической активности химических соединений на стадии предбиологических испытаний. Изобретение предназначено для отбора наиболее эффективных из биологически активных веществ в ряду новых веществ, полученных путем химической модификации исходного соединения и предназначенных для воздействия на одну и ту же биологическую функцию. Известен способ определения биологической активности .химических со динений путем взаимодействия тестируемьк соединений в растворе с возбужденным светом красителем, которы заключается в том, что определяют величину начальной вспышки послесве чения раствора хлореллы, которую пр нимают за 100%, затем в свежий раст вор хлореллы добавляют раствор антлбиотика заранее известной концент рации и строят стандартную кривую снижения интенсивности начальной вспышки послесвечения хлореллы в присутствии известных доз антибиотика. Измеряют интенсивность послесвечения испытуемого образца и по стандартной кривой определяют актив ность антибиотика, содерл;ащегося в этом образце, т.е. по сути дела его концентрацию. В основе этого способ лежит взаимодействие тестируемого в щества (т.е.полиенового антибиотика ) с красителем (в данном случае хлорофиллом), находящимся в возбужденном светом cocтoянииJ в результате чего уменьшается флуоресценция клеток хлореллы. Недостаток этого способа заключается в том, что он сложен в связи с необходимостью культивирования хлореллы, предназначен для определе ния активности только одного класса веществ и мало пригоден для олределения биологической активности новы веществ, поскольку не содержит корр ляций между биологической активностью известных соединений и их вл янием на флуоресценцию хлореллы. Целью изобретения является упрощение способа. Цель достигается в способе определения биологической активности химических соединений путем взаимо32действия тестируемых соединений в растворе с возбужденным светом красителем, тем, что образец, содержащий тестируемое соединение, краситель и восстановленный никотинамидадениндинуклеотид, а также контрольный образец без тестируемого соединения освобождают от кислорода, освещают светом в полосе поглощения красителя и измеряют начальную скорость снижения оптической плотности или флюоресценции красителя или его радикалов в присутствии тестируемого соединения, причем среди соединений одного класса большей скорости выцветания соответствует более высокая биологическая активность. Способ поясняется следующими примерами. П. р и м е р 1 , Определение биологической активности нейромедиатора дофамина и предшественников его биосинтеза - ДОФА и тирозина. В оптическую кювету, снабженную вакуумным краном, помещают контрольный образец: 2 мл буферного раствора (трис-НС 0,01 М рН 7,о;, содержащего краситель зозин (l.IO М) и восстановитель - восстановленный никотинамидофенилдинуклеотид (НАД-Н, 5.10 М). Образец освобождают от растворенного кислорода осторожной откачкой на форвакуумном насосе 1.10-3 мм.рт.ст.)в течение 30 мин. Деаэрированный контрольньй образец помещают в термостатированное кювет- ное отделение спектрофотометра СФ-10, позволяющее освещать образец непрет рьшньм светом лампы накаливания мощностью 100 Вт. Нужный участок спектра вьщеляют светофильтром ЖС-16. Через равные интервалы времени освещения (10с) фиксируют уменьшение максимума поглощения красителя на 517 нм и изображают на графике или в таблице кинетику выцветания красителя. Опытный образец, содержащий кроме зозина и НАД-Н в концентрациях, равных таковым в контрольном образце, также и тестируемое вещество-дофамин (1. М ) подвергают тем же процедурам, что и контрольный, и результаты измерений выцветания красителя наносят на один и тот же график . Аналогичным образом измерены предшественники дофамина ot-ДОФА и тирозин (см. табл.1 ). Из данных табл.1 следует, что дофамин наибодее сильно замедляет выцветание красителя эозина. Как известно из л тературных данных, дофамин обладает и наивысшей биологической активностью как :Нейтромедиатор, являясь конечным продуктом биосинтеза. Менее активен биологически его предшественник 0 -ДОФА, и он не столь сильно тормозит выцветание красителя,, проявляя более слабые электронно-акцепторные свойства. Исходный продукт биосинтеза-тирозин, характеризующийся незначительным медиаторным действием, в наименьшей степени влияет на кинетику фото Кинетика выцветания контрольном образце в шественников его био рози выцветания эозина. Таким образом, имеет место корреляция между биологической активностью изученных веществ и их способностью замедлять фотовыцветание красителя, т.е. их электронно-акцепторными качествами. Обнаруженная корреляция биологической активности производных дофамина с их электронно-акцепторными свойствами позволяет прогнозировать биологическую активность новых лекарств на основе дофамина путем измерения их электронно-акцепторных свойств.. Таблица еля (лА) эозина в ствии дофамина и преда о -ДОФА и ти

Время освещения,с

Выцветание

Контроль

Тирозин

о -ДОФА

Дофамин

Примечание: Пример 2. Определение биологической активности нейролептиков-аминазина (хлоропромазина) и его производных. Исследуют аминазин и его производные: этаперазин и трифтазин. Поскольку нейролептики образуют прочный комплекс с эозином в качестве красителя, в этом примере используют флуоресцеин-краситель, близкий по строению к зозину. Об образовании комплекса свидетельствует смещение

30

40

20

56

45 7,5 1,5

Выцветание красителя (А ) указано в делениях икалы спектрофотометра СФ-10. Для,получения выцветания красителя в единицах оптической плотности указанные цифры нужно умнокить на 0,0125 Д полосы поглощення зозина в присутствии этих веществ. Контрольный образец, содержащий 2 мл буферного раствора ( трис-НС1 0,01 М рН 7,0), краситель флуоресцеин (l.) и восстановитель НАД-Н {5.10)помещают в оптическую кювету, снабженную вакуумньм краном и подвергают процедурам, описаяньм в примере 1. Через каждые 15 с фиксируют уменьшение максимума поглощения фду

S1

оресценции на Л 490 нм и строят кривую его кинетики выцветания.

Опытный образец, содержащий 2 мл буферного раствора (как и контрольный ), флуоресцеин и НАД-Н в тех же концентрациях,что и контрольный образец, а также тестируемое вещество аминазин, подвергэпи тем же процедурам, что и контрольный образец и строят кривые кинетики выцвечивания флуоресцеина в присутствии аминезина при следующих его концентрациях: 5.10- М и 1,7..

Затем последовательно были построены кривые выцветания флуоресКонцентрации производных аминазина, вызывающие одинаковое замедление выцветания зозина за первые 15.с освещения образца и их известная биологическая активность

Аминазин

Концентрация, вызывающая равное замедление выцветаКак видно из табл.2, одинаковую степень замедления выцветания красителя наблюдают при различной концентрации нейролептиков - наименьшей у трифтазина (5. )и наибольшей у исходного вещества - аминазина (1,7.10 М 1 В той же последовательности находится и их биологическая активность, определяемая по суточной дозе. В данном примере наблюдается и количественная пропорционал ность между физиологической актив ностыэ членов гомологического ряда (доза ) и интенсивностью их электронно-акцепторных взаимодействий с радикалами красителя (концентрация вещества, в заданной степени замедляющая выцветание красителя }. Пример 3. Определение биоло гической активности нейромедиатора норадреналина и его антагонистов фентоламкна и атенолола, веществ.

431936

цеина в опытных образцах, содержащих {кроме флуоресцеина и КАДН в буферном растворе , как и контроль ) производные аминазина в различных 5 концентрациях: атаперазин 1,6. и З. и трифтазин 1 ,5. 10 М и 5.10-М.

На основании ползгченных кривых 10 определены концентрации аминазина и его производных, при которых происходит одинаковое выцветание флуоресцеина за первые 15 с освещения образца. Эти данные приведены в 15 табл.2.

Таблица

Трифтазин

Этаперизин характеризующихся противоположным воздействием на функцию передачи нервного импульса и сопоставление ее с их биологической активностью, описанной в литературе. Исследуют норадреналин, фентоламин и атенолол. Противоположное физиологическое действие тестируемых веществ предполагает, что одни из них являются акцепторами, другие - донорами электронов. Свойства доноров электронов целесообразно- оценивать при импульсном освещении образцов. Контрольный образец, состоящий из 2 мл буферного раствора (трисНС1 0,01 М, рН 7,0 ),содержащего краситель эозин (l. ) и восстановитель НАД-Н (5. ) помещают в оптическую кювету, снабженную вакуумным краном, освобождают от растворенного кислорода (как описано в примере 1) и помещают в кюветное от