Способ получения смеси биогенных аминов дофамина, тирамина и триптамина Российский патент 2024 года по МПК C12P13/00 C12P17/10 A61K31/137 A61K31/4045 A61K36/10 B01D11/02 

Настоящее изобретение относится к медицине, а именно к химико-фармацевтической промышленности, и может быть использовано для получения ряда биогенных аминов - дофамина, тирамина и триптамина с использованием сырья моховидного растения - печеночного мха Marchantia polymorpha. Содержание в растительной массе моховидных растений ряда биогенных аминов и возможность реализации способа получения биогенных аминов путем экстракции из растительного сырья дают возможность применения предлагаемого изобретения в фармацевтических и биомедицинских производствах.

Marchantia polymorpha L., или маршанция многообразная - представитель семейства Marchantiaceae. Печеночный слоевищный мох. Двудомное растение. Является космополитным видом, встречается на всех континентах. Произрастает в сырых местообитаниях, по берегам ручьев, на скалах, на пожарищах, избегая конкуренции с другими растениями. Имеет дихотомически ветвящийся лентовидный таллом, длиной до 20 см с углублением на вершине, где располагается точка роста. Растение способно как к половому, так и к бесполому размножению.

Биогенные амины - низкомолекулярные вещества, образующиеся в организмах животных, человека и растений из аминокислот и являющиеся биологически активными молекулами, которые оказывают значительное влияние на организм. Типовыми представителями биогенных аминов выступают дофамин, триптамин, тирамин и др.

Дофамин представляет собой моноаминовое соединение с положительной инотропной активностью. Встречается в природе в виде катехоламина, образующегося в результате декарбоксилирования дегидроксифенилаланина. Является предшественником норэпинефрина и адреналина. Выполняет функции кардиотонического препарата, бета-адренергического агониста, дофаминергического агента и симпатомиметического агента.

Триптамин представляет собой аминоалкилиндол, состоящий из индола, имеющего 2-аминоэтильную группу в положении С-3. Является промежуточным звеном при биосинтезе большинства индольных алкалоидов и алкалоидов группы хинина. Большинство производных триптамина обладают психоактивными свойствами.

Тирамин представляет собой первичный амин, полученный декарбоксилированием тирозина. Биологически активен, в связи с сосудосуживающим действием повышает кровяное давление, влияет на процессы возбуждения и торможения в нервной системе.

Приведенные биогенные амины применяются в профилактике и терапии нейродегенеративных заболеваний.

Из существующего уровня техники известно, что существует несколько способов получения биогенных аминов. Известен способ получения дофамина из культур корневых волосков Beta vulgaris RU, патент РФ на изобретение RU 2326946 С2 (WO 2004/055192). Способ заключается в получении целевого продукта из культивированных клеток на питательных средах. Недостатком данного метода является трудоемкий способ получения культур клеток - продуцентов и требования по обеспечению стерильности производства.

Известен патент РФ на изобретение «Продуцент дофамина» RU 2737557 С1, в котором предложено средство для получения дофамина - штамм Bacillus cereus ВКПМ В-12401, продуцирующий дофамин. Недостатком средства являются малые выходы целевого продукта (12 пг/мл), необходимость пересевов, вырождение культуры продуцента, требования по обеспечению стерильности производства.

Известен химический способ получения тирамина, приведенный в патенте РФ на изобретение RU 2218326 С2 - «Способ получения 4-(2-аминоэтил)фенола». Приведенный способ позволяет с высоким выходом получить гидробромид тирамина из доступного исходного соединения в две химические стадии из фенола без выделения и очистки промежуточного вещества - 4-(2-бромэтилфенола). Недостатком данного способа является использование дорогого химического сырья и получение побочных высокотоксичных продуктов.

Наиболее близким к заявленному техническому решению (прототипом) является способ по патенту RU №2326946 С2 (WO 2004/055192). Недостатки известного технического решения приведены выше. Кроме того, в отличие от способа-прототипа, основным биологическим агентом которого являются клетки корневых волосков Beta vulgaris, которые можно получить только с помощью ручного труда в малых количествах, в рамках предлагаемого изобретения использованы растения мхов, выращенные в нестерильных условиях и способные обеспечивать быстрый прирост биомассы.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка способа одновременного получения ряда биогенных аминов из растительного сырья, а именно из моховидного растения Marchantia polymorpha.

Технический результат - одновременное получение ряда биогенных аминов - дофамина, триптамина и тирамина значительно дешевле, без использования многостадийных процессов химического и микробиологического синтеза, а также отсутствие токсичных отходов в виде органических растворителей, аммиака и других химических агентов.

Технический результат достигается тем, что предлагаемый способ получения смеси биогенных аминов дофамина, триптамина и тирамина включает выращивание моховидного растения Marchantia polymorpha в лабораторных условиях при комнатной температуре в диапазоне 18-25°С в контейнерах, заполненных на по объему стерилизованным увлажненным грунтом, песком и камнями в соотношении по объему 1:1:1 с последующим снятием М. polymorpha с субстрата, измельчением моховидного растения, экстрагированием смеси биологически активных веществ из измельченного растительного сырья М. polymorpha в присутствии растворителя метилового спирта в соотношении измельченная биомасса растения : объем растворителя, равном 1 к 10, в условиях перемешивания на протяжении 1 часа, затем центрифугирование при скорости 4 тыс.об/мин на протяжении 10 минут, далее охлаждение в термостате при температуре 6°С на протяжении 8 часов, после чего повторное центрифугирование при 13,5 тыс. об/мин, фильтрацию полученного экстракта.

Разработанный способ обладает рядом преимуществ ввиду удешевления процессов получения ряда биогенных аминов за счет следующих факторов:

- моховидные растения могут быть выращены (культивированы) в контролируемых, неконтролируемых и в условно контролируемых условиях (температурные условия, условия освещенности, тип и состав спектра света);

- моховидные растения могут быть выращены в питательных средах с низкой концентрацией минеральных элементов, на уровне содержания последних в водопроводной воде;

- моховидные растения могут быть выращены в средах и в воде без добавления низкомолекулярных гормонов;

- моховидные растения могут синтезировать метаболиты в нестерильных условиях.

Изобретение иллюстрируется следующими чертежами:

Фиг. 1 - Хроматограмма экстракта образца мха М. polymorpha, выращенного в лабораторных условиях. Молекулярный ион тирамина 138.0 Да (диагностические ионы 121.1 Да, 103.0 Да, 93.1 Да, 91.0 Да, 77.0 Да).

Фиг. 2 - Хроматограмма экстракта образца мха М. polymorpha, выращенного в лабораторных условиях. Молекулярный ион триптамина 161.0 Да (диагностический ион 144.0 Да).

Фиг. 3 - Хроматограмма раствора стандартного образца дофамина 2 мг/л. Молекулярный ион дофамина 154,0 Да (диагностические ионы 137,0 Да и 91,0 Да).

Фиг. 4 - Хроматограмма экстракта образца мха М. polymorpha, выращенного в лабораторных условиях. Молекулярный ион дофамина 154,0 Да (диагностические ионы 137,0 Да и 91,0 Да).

Способ осуществляется следующим образом.

Растения мха Marchantia polymorpha культивировали в лабораторных условиях, при комнатной температуре в диапазоне 18-25°С. Для культивирования мха использовали полипропиленовые прозрачные контейнеры, заполненные на грунтом, песком и камнями в соотношении 1:1:1. Субстрат стерилизовали в автоклаве при 121°С. Далее некоторое начальное количество биомассы растений мха М. polymorpha измельчали блендером в водопроводной воде и орошали ими подготовленный субстрат. Каждый 3 дня мхи орошали водопроводной водой или раствором питательной среды Тамия в различных концентрациях (от 1 до 10%). Среду Тамия готовили в соответствии с ПНД Ф Т 14.1:2:4.10-2004 Т 16.1:23:3.7-2004. Водопроводную воду предварительно отстаивали в пластиковых емкостях. Для освещения использовали фитолампы с фотопериодом 12/12 ч, фотосинтетическим фотонным потоком 9 мкмоль/с. Культивацию проводили на протяжении 8 недель, или до прироста биомассы в объеме не менее чем на 50%.

Образцы мха снимали с подложки и промывали в потоке водопроводной воды. Затем мхи измельчали блендером в метаноле (100%, ХЧ) в соотношении 1 к 10, обеспечив тем самым экстракцию из измельченного растительного сырья природных биологически активных веществ - биогенных аминов. Затем образец оставляли в условиях перемешивания на протяжении 1 часа. Образцы центрифугировали при скорости 4 тыс.об/мин. на протяжении 10 минут. Затем образцы помещали в термостат при температуре 6°С на 8 часов, после чего образцы повторно центрифугировали при 13,5 тыс. об/мин и переносили в виалы, предварительно профильтровав экстракты через PTFE шприцевые фильтры (0,45 мкм) для хромато-масс-спектрометрического анализа.

Содержание в полученном из измельченного растительного сырья М. polymorpha целевых продуктов подтверждено путем хромато-масс-спектрометрического анализа. Общий хромато-масс-спектрометрический анализ образцов проводили на базе хромато-масс-спектрометра Agilent Technologies Infinity II с масс-спектрометрическим детектором 6470 В. Хроматографические условия представлены в таблице 1.

Режимы хроматографирования и работы масс-спектрометрического детектора представлены в таблицах 2 и 3.

Выявление в полученном экстракте биогенных аминов проводили с применением аналитических стандартов и совокупности MRM-переходов при фрагментации молекул. MRM - переходы, используемые в качестве диагностических, приведены в таблице 4 ниже [Wallace W. Е. Mass spectra //NIST chemistry webbook, NIST standard reference database. - 2018. - №. 69.]:

Для идентификации и установления концентрации дофамина, полученного в экстракте из растительного сырья мха Marchantia polymorpha, применяли аналитический стандарт дофамина гидрохлорида (Sigma -Aldrich, lot № BCBV9268).

Хромато-масс-спектрометрический анализ по определению концентрации дофамина в экстракте проводили на базе хромато-масс-спектрометра Agilent Technologies Infinity II с масс-спектрометрическим детектором 6470 В. Хроматографические условия представлены в таблице 5.

Заявленный способ поясняем следующими примерами:

Пример 1. Выявление тирамина в экстрактах мха М. polymorpha при выращивании мха в лабораторных условиях и экстракции тирамина из растения и из субстрата, на котором произрастало растение.

На фиг. 1. представлены материалы, характеризующие хроматограммы MRM-переходов тирамина. Тирамин обнаружен в образцах мха М. polymorpha, выращенного в лабораторных условиях, описанных выше. Тирамин получен посредством измельчения сырья и экстракции раствором метилового спирта. Анализ субстрата, на котором был выращен мох, указывает на отсутствие тирамина, что свидетельствует о внутриклеточном (экзогенном) синтезе тирамина в концентрации 1 мг/кг. Сводные материалы представлены в таблице 6.

Пример 2. Выявление триптамина в экстрактах мха М. polymorpha при выращивании мха в лабораторных условиях и экстракции триптамина из растения и из субстрата, на котором произрастало растение.

На фиг. 2. представлены материалы, характеризующие хроматограммы MRM-переходов триптамина. Триптамин обнаружен в образцах мха М. polymorpha, выращенного в лабораторных условиях, описанных выше. Триптамин получен посредством измельчения сырья и экстракции раствором метилового спирта. Анализ субстрата, на котором был выращен мох, указывает на отсутствие триптамина, что свидетельствует о внутриклеточном синтезе триптамина в концентрации 1 мг/кг. Сводные материалы представлены в таблице 7.

Пример 3. Выявление дофамина в экстрактах мха М. polymorpha при выращивании мха в лабораторных условиях и экстракции дофамина из растения и из субстрата, на котором произрастало растение.

На фиг. 3. представлены материалы, характеризующие MRM-переходы стандартного образца дофамина. На фиг. 4 представлены материалы, характеризующие MRM-переходы дофамина в полученных экстрактах мха. Дофамин обнаружен в образцах мха М. polymorpha, выращенного в лабораторных условиях, описанных выше. Дофамин получен посредством измельчения сырья и экстракции раствором метилового спирта. Анализ субстрата, на котором был выращен мох М. polymorpha, также указывает на наличие дофамина в среде. Эндогенная (внутриклеточная) концентрация дофамина составляет 2 мг/кг биомассы мха. Экзогенная (внеклеточная) концентрация дофамина в воде составляет 2 мг/кг субстрата. Сводные материалы представлены в таблице 8.

Таким образом, предлагаемое изобретение может быть внедрено в практику фармацевтических и биомедицинских предприятий, направленных на получение биогенных аминов, в т.ч. дофамина, триптамина и тирамина. Принимая во внимание преимущества данного способа, в т.ч. одновременное получение ряда названных биогенных аминов, отсутствие требований по стерильности производственного процесса, выраженный экзогенный синтез, а также широкий спектр условий культивирования мха, использование мхов М. polymorpha является конкурентным способом получения биогенных аминов.

Список литературы:

1. Патент РФ RU 2218326 С2 - "Способ получения 4-(2-аминоэтил)фенола". Авторы: Крысин А.П., Егорова Т.Г., Просенко А.Е., Кобрин B.C.

2. Патент РФ RU 2326946 С2 (WO 2004/055192) - "Способ получения ДОФА и дофамина из культур корневых волосков Beta vulgaris". Авторы: Токаре Р.А., Бхамиди С, Рао Р.С.

3. Патент РФ RU 2737557 C1 - "Продуцент дофамина". Авторы: Петров С.А., Субботин A.M., Костоломова Е.Г., Акунеева Т.В.

4. Wallace W.Е. Mass spectra //NIST chemistry webbook, NIST standard reference database. - 2018. - №. 69.

Изобретение относится к области химии и фармацевтики, а именно к способу получения смеси биогенных аминов дофамина, триптамина и тирамина, включающий выращивание моховидного растения Marchantia polymorpha в лабораторных условиях при комнатной температуре в диапазоне 18-25°С в контейнерах, заполненных на 1/3 по объему стерилизованным увлажненным грунтом, песком и камнями в соотношении по объему 1:1:1 с последующим снятием М. polymorpha с субстрата, измельчением моховидного растения, экстрагированием смеси биологически активных веществ из измельченного растительного сырья в присутствии растворителя метилового спирта в соотношении измельченная биомасса растения : объем растворителя, равном 1 к 10, в условиях перемешивания на протяжении 1 часа, затем центрифугирование при скорости 4 тыс. об/мин на протяжении 10 минут, далее охлаждение в термостате при температуре 6°С на протяжении 8 часов, после чего повторное центрифугирование при 13,5 тыс. об/мин, фильтрацию полученного экстракта. Технический результат заключается в одновременном получении ряда биогенных аминов – дофамина, триптамина и тирамина, без использования многостадийных процессов химического и микробиологического синтеза, а также отсутствии токсичных отходов в виде органических растворителей, аммиака и других химических агентов. 4 ил., 8 табл., 3 пр.

Способ получения смеси биогенных аминов дофамина, триптамина и тирамина, включающий выращивание моховидного растения Marchantia polymorpha в лабораторных условиях при комнатной температуре в диапазоне 18-25°С в контейнерах, заполненных на 1/3 по объему стерилизованным увлажненным грунтом, песком и камнями в соотношении по объему 1:1:1 с последующим снятием М. polymorpha с субстрата, измельчением моховидного растения, экстрагированием смеси биологически активных веществ из измельченного растительного сырья в присутствии растворителя метилового спирта в соотношении измельченная биомасса растения : объем растворителя, равном 1 к 10, в условиях перемешивания на протяжении 1 часа, затем центрифугирование при скорости 4 тыс. об/мин на протяжении 10 минут, далее охлаждение в термостате при температуре 6°С на протяжении 8 часов, после чего повторное центрифугирование при 13,5 тыс. об/мин, фильтрацию полученного экстракта.