Способ определения электронно-донорной активности химических соединений Советский патент 1987 года по МПК G01N33/48 

Изобретение, относится к биохимии .и биофизике и может быть использовано в фармакологии для первичной оцен-|- ки биологической активности химических соединений на стадии предбиоло- гическшс испытаний,

. Целью изобретения является повышение чувствительности способа за счет введения в образцы гемсодержа- щего соединения.

Способ осуществляют следующим образом.

В контрольньй и опытные образцы вводят гемсодержащее соединение, которое, являлясь акцептором электронов, изменяющий свой цвет при восстановлении, служит удобным тест-соединением для определения электронно- донорной активности химических соединений. Затем опытньй и контрольный образцы освещают непрерывным светом и измеряют начальную скорость изменения оптической плотности в полосе поглощения гемсодержащего соединения. Электронно-донорную активность тес- Iтируемого соединения определяют по увеличению скорости изменения оптической плотности в опытном образце по сравнению с контрольным.

При этом для определения элек- тронно-донорной активности водорас- творяемых соединений в качестве гемсодержащего соединения используют гемсодержащий блок, а для водонерас- творимых соединений - гемин.

Выбор в качестве тест-соединения именно гемсодержащих соединений определяется высоким значением их коэффициента экстинкции, составляющим

а также удовле1-1,5-105 М см- творительным (около 20 нм) разнесением полос поглощения восстановленной и окисленной формы этих соединений, что в совокупности и обеспечиto

f5

20

25

30

35

40

держащийся в растворе кислород пу осторожной откачки на форвакуумно насосе (до ) в течение 30 Деаэрированный образец поместили термостатированное кнЗветное отдел ние спектрофотометра СФ-10 (можно также использовать СФ-14 или Спек и записали исходный спектр поглощения опытного о.бразца. Затем это образец освещали светом лампы нак ливания (100 Вт), пропущенным чер светофильтр же-18 ( А / 500 нм), и писывали спектр поглощения образц через 1,2,3,4,5 и 6 мин освещения

Освещение опытного образца при водит к изменению спектра поглоще акцептора электронов-миоглобина. этом исходная полоса поглощения о ленного миоглобина уменьщается и растает более длинноволновая поло соответствующая восстановленной ф ме миоглобина.

По приращению поглощения длинн в олновой полосы за время освещени опытного образца в течение 1,2,3 4 мин строили кинетическую кривую товосстановления миоглобина в при ствии риосидила.

Такие же операции проводили и контрольным образцом, не содержащ риосидила и строили кинетическую вую .восстановления миоглобина в к трольном образце.

Аналогично тестировали верапам (содержание ei o в опытном образце 1-10 М) и дилтиазем (содержание опытном образце 1 -lO М) и строил кривые восстановления мио-глобина их отсутствии.

За 1-ю мин освещения контрольн и опытного (с риосидилом) образцо миоглобин в присутствии риосидила восстанавливается почти в 6 раз (

вает высокую чувствительность предла- 45 быстрее, чем в контроле (так, за

гаемого способа.

Пример 1. Определение электронно -донорной активности блокато- ров кальциевых каналов у риосидила, верпамила, дилтиазема (все соединения водорастворимы) по .восстановлению миоглобина.

Опытный образец, представляющий собой.водный раствор объемом 2 мп, содержащий 1 красителя эозина, 1 миоглобина и I-IO M риосидила, поместили в герметизированную оптическую кювету и удалили со

5

0

5

0

5

0

держащийся в растворе кислород путем осторожной откачки на форвакуумном насосе (до ) в течение 30 мин. Деаэрированный образец поместили в термостатированное кнЗветное отделение спектрофотометра СФ-10 (можно также использовать СФ-14 или Спекорд) и записали исходный спектр поглощения опытного о.бразца. Затем этот образец освещали светом лампы накаливания (100 Вт), пропущенным через светофильтр же-18 ( А / 500 нм), и записывали спектр поглощения образца через 1,2,3,4,5 и 6 мин освещения.

Освещение опытного образца приводит к изменению спектра поглощения акцептора электронов-миоглобина. При этом исходная полоса поглощения окисленного миоглобина уменьщается и возрастает более длинноволновая полоса, соответствующая восстановленной форме миоглобина.

По приращению поглощения длинно- в олновой полосы за время освещения опытного образца в течение 1,2,3 и 4 мин строили кинетическую кривую фотовосстановления миоглобина в присутствии риосидила.

Такие же операции проводили и с контрольным образцом, не содержащим риосидила и строили кинетическую кривую .восстановления миоглобина в контрольном образце.

Аналогично тестировали верапамил (содержание ei o в опытном образце 1-10 М) и дилтиазем (содержание в опытном образце 1 -lO М) и строили кривые восстановления мио-глобина в их отсутствии.

За 1-ю мин освещения контрольного и опытного (с риосидилом) образцов миоглобин в присутствии риосидила восстанавливается почти в 6 раз (5,7)

2 мин освещения в опытном образце восстанавливалось 40% содержащегося в образце акцептора миоглобина, за то же время в контрольном образце

50 восстановилось всего 7% миоглобина). Восстановление миоглобина за 1-ю мин освещения опытных образцов двумя другими блокаторами кальциевых каналов - верапамилом и дилтиаземом 55 происходит с одинаковой скоростью, которая примерно в 3 раза меньще, чем в образце с риосидилом.

Таким образом, наибольший элек- тронно донорной активностью обладает

риосиднл,а верапамил и дилтиазем обладают одинаковой электронно-донор- ной активностью.

Определенное предлагаемым способом различие в электронно-донорной активности блокаторов кальциевых каналов, а именно, риосидил : верапамил дилтиазем, коррелирует с их биологической активностью, наблюдаемой в электрофизиологических исследованиях .

Для сравнения чувствительности предлагаемого способа и способа по прототипу построены кинетические кривые уменьшения поглощения анион-ради- J5 оптическую кювету и дэаэрировали как калов красителя иозина при импульс- описано в примере 1. Таким же обра- ном освещении контрольного образца зом готовили контрольный образец, и опытных образцов, содержащих не содержащий фелодипина.

0,,7 раза по предлагаемому способу.

Следовательно, предлагаемый способ чувствительнее известного в 3 ра- 5 за (5,7:1,.).

Пример 2. Определение электронно-донорной активности блокато- ра кальциевых каналов - фелодипина (водорастворимое соединение; по восстановлению цитохрома С.

. Опытный образец объемом 2 мл, содержащий водный раствор красителя эозина (1-10 М) цитохрома С ( и фелодипина (), поместили в

fO

-,-4

1-10 М риосидила и 25 10 М риосиди- ла. Начальная скорость исчезновения 20 радикалов красителя равна 5 в произвольных единицах (отношение уменьшения концентрации анионов красителя ко времени освещения образца). В опытном образце, содержащем бло- 25 катора каналов риосидила, начальная скорость изчезновения радикалов замедлилась до 2,7 в тех же единицах. Таким образомj отличие в величине измеряемого эффекта, вызываемого одинако- 30 вой концентрацией тестируемого вещества, в контрольном и опытном образцах составляет по способу-прототипу 5:2,,8 раза по сравнению с 0,40:

Контрольный и опытный образцы исследовали на обычном спектрофотометре СФ-10 так же, как описано в примере 1, и записывали спектр поглощения образцов через каждые 3 мин осве щения их непрерывным светом.

При освещении образцов происходит фотовосстановление цитохрома с увеличением полосы поглощения с макси- мумом на 416 нм (максимум поглощения окисленного цитохрома С - 410 нм).

В таблице представлена кинетика фотовосстановления акцептора элек- тронов цитохрома С блокатором кальциевых каналов фелодипином, в контрольном и опытном образцах.

Увеличение поглощения на 416 нм

Доля восстановленного цитохрома С

Начальная (за первые 2 мин осве- щения) скорость фотовосстановления цитохрома С в присутствии фелодипина составила 19%, в то время как при тех же условиях освещения фотовосста- нрвление цитохрома С в контрольном образце за первые 2 мин освещения составило всего 2%. Таким образом, фелодипин ускоряет фотовосстановле- ние акцептора жлектронов цитохрома С примерно в 10 раз, что свидетельствует о его высокой электронно-до5 оптическую кювету и дэаэрировали как описано в примере 1. Таким же обра- зом готовили контрольный образец, не содержащий фелодипина.

0,,7 раза по предлагаемому способу.

Следовательно, предлагаемый способ чувствительнее известного в 3 ра- 5 за (5,7:1,.).

Пример 2. Определение электронно-донорной активности блокато- ра кальциевых каналов - фелодипина (водорастворимое соединение; по восстановлению цитохрома С.

. Опытный образец объемом 2 мл, содержащий водный раствор красителя эозина (1-10 М) цитохрома С () и фелодипина (), поместили в

O

Контрольный и опытный образцы исследовали на обычном спектрофотометре СФ-10 так же, как описано в примере 1, и записывали спектр поглощения образцов через каждые 3 мин освещения их непрерывным светом.

При освещении образцов происходит фотовосстановление цитохрома с увеличением полосы поглощения с макси- мумом на 416 нм (максимум поглощения окисленного цитохрома С - 410 нм).

В таблице представлена кинетика фотовосстановления акцептора элек- тронов цитохрома С блокатором кальциевых каналов фелодипином, в контрольном и опытном образцах.

0,125 0,275 0,40 0,44 0,45 0,25 0,55 0,80 о ,88 0,90

норной активности. Кроме того, гем- содержащий белок - цитохром С может быть успешно использован в качестве акцептора электронов, изменяющего свой спектр поглощения при восстановлении, для определения электронно-донорной активности химических соединений.

П р и м е р 3. Определение электронно-донорной активности водоне- растворимьк соединений аймалина и

бензокаина (блокатры натриевых каналов) С по восстановлению гемина.

Опытньш образец объемом 2 мл, содержащий в качестве растворителя смесь диметилсульфоксида и. воды в отношении 4:1, а также краситель эри- трозин (иодзамещенный аналог краси- ,теля эозина) (1,) акцептор электронов гемин -1,5-10 М и тестируемое соединение аймалин -1 помещали в герметическую оптическую кювету и подвергали процедурам, описанным в примере 1.

Освещение опытного образца приводит к изменению спектра поглощения акцептора электронов - гемина. При этом исходная полоса поглощения окисленного гемина уменьшается и возрастает более длинноволновая полосаформе гемина.

По приращению поглощения длинноволновой полосы за время (в течение 5,10,15 мин) освещения опытного образца строили кинетическую кривую, фотовосстановления гемина в присутствии аймалина.

Такие же операции проводили и с контрольным образцом, не содержащим аймалин, и строили кинетическую кривую восстановления гемина.

Из сравнения кривых видно, что аймалин является эффективным донором электронов (восстановление гемина в присутствии аймалина за первые 2 мин освещения образцов почти в 12 раз быстрее, чем в контрольном образце), что хорошо согласуется с биологической активностью аймалина-антиаритмика

Аналогично тестировали бензокаин (1 -Ю Зм) - блокатор натриевых каналов и строили кривую фотовосстановления гемина в его присутствии.

Бензокаин обладает хотя и слабой

становление гемина в присутствии бензокаина только в 2 раза быстрее, чем в контроле, за первые 2 мин освещения образцов), но достаточно хорошо детектируемой предлагаемым способом.

При исследовании бензокаина способом-прототипом его электронно-до- норные свойства не обнаруживаются, что также свидетельствует о более О высокой чувствительности предлагаемого способа.

Формула изобретения

}5 1 Способ определения электронно- донорной активности химических соединений путем регистрации взаимодействия тестируемых соединений в растворе с красителем, включающий освесоответствующая восстановленной 20 п;ение образца в полосе поглощения

красителя с последующим спектрофото- метрированием, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, в контрольный и

25 опытный образцы дополнительно вводят гемсодержащее соединение, образцы освещают непрерывным светом и измеряют начальную скорость изменения оптической плотности в полосе погло30 щения гемсодержащего соединения и по увеличению скорости изменения оптической плотности определяют электрон- но-донорнуй активность.

2. Способ по п. 1, отличаю35 Щ и и с я тем, что, с целью определения электронно-донорной активности водорастворимых соединений, в качестве гемсодержащего соединения используют гемсодержащий белок.

40 3. Способ по п. 1, о т л и ч а -ю- щ и и с я тем, что, с целью определения электронно-донорной активности водонерастворимых соединений, в качестве гемсодержащего соединения исэлектронно-донорной активностью (вое- 45 пользуют гемин.

Редактор Е. Копча

Составитель Н. Гуляева Техред М.Ходанич

Заказ 2655/49Тираж 776

ВНИИПИ Государственного комитета СССР ,

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Корректор В. Бутяга Подписное

Изобретение относится к биофизике и биохимии. Цель изобретения - повьшение чувствительности способа. В контрольный и опытный образцы вводят гемсодержащее соединение, освещают непрерывным светом и измеряют начальную скорость изменения оптической плотности в полосе поглощения гем- содержащего соединения. Электронно- донорную активность тестируемого соединения определяют по увеличению скорости изменения оптической плотности в опытном образце по сравнению с контрольным. Выбор в качестве тест- соединения гемсодержащих соединений определяется высоким значением их коэффициента экстинкции, а также удовлетворительным разнесением полос поглощения восстановленной и окисленной форм этих соединений. 2 з.п. ф-лы, § 1 табл. (Л со ю о со