Способ получения растительного полимера-эпигалохина Советский патент 1985 года по МПК C07D311/62 A61K31/352 A61K31/80 A61K35/78 A61P7/00 

экстракта этилацетатом, высушиванием, измельчением экстракта в порошок с последующей счисткой его от низкомолекулярных примесей трехкратным кипячением с этилацетатом и высушиванием полученного порошка при темпера-; туре ЗО-бО С и остаточном давлении 1-10 мм рт.ст. до постоянного веса.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО ПОЛИМЕРА-ЭПИГАЛОХИНА формулы (Л ел :л з: гдеи - целое число, равное 1-5, с молекулярной массой 5000-10000, отличающийся тем, чтокорни родиолы Семенова экстрагируют А 25-70%-ным ЭТИЛОВЫМ спиртом с последующей обработкой сконцентрированного

Изобретение относится к способу получения нового растительного полимера -(4,8), (4,6) (-)-2,3-цис-(2Я,31)-3,4-транс-(ЗК,45)-3,3 ,4 ,5,7-пен. таоксифлаван: (-)-2,3-цис-(2,ЗК)-3,4-транс-(ЗК,45)-3-0-галло-3 ,4 ,5, 6, 7-пентаоксифлавана (эпигалохина) .формулы

oблaдaюD eгo противогипоксической активностью.

Цель достигается тем, что согласно предлагаемому способу корни -родиоЛы Семенова экстрагируют 257Т)%-ным этиловым спиртом с последующей обработкой сгущенного экстракта этилацетатом, высушиванием, измельчением экстракта в порошок с последующей очисткой его от низкомолекулярных примесей трехкратным кипячением с этилацетатом и сушкой полученного порошка при температуре 30-60 Си остаточном давлении 1-10 мм рт.ст. до постоянного веса.

Способ осуществляют следующим образом.

Воэдушно-сухие измельченные корни родиолы Семенова при комнатной температуре экстрагируют 25-70%-ным этиловым спиртов порциями, взятыми в соотношении к сырью 1:5-1:6 (весобъем) четыре- шестикратно, каждый раз по 12-24 ч. Затем концентрированные в 30 раз упариванием в вакууме при 30-60 С объединенные экстракты пятикратно обрабатывают порциями этилацетатом, взятыми в соотношении к экстракту 1:0,4-1:1 (объем-объем). Этилацетатные фракции отделяют, очищенный водно-спиртовый экстракт упаривают в вакууме при 30-60°С, остаток измельчают в порошок и повторно обрабатывают этилацетатом, взятым в соотношении к порошку 1:1,5-1:3 (вес-объем), в колбе с обратным холодильником на водяной бане в течение 15 мин при кипячении. После охлаждении и отстаивания этилацетатный раствор сливают. Обработку порошка этилацетатом повторяют 3 раза. Очищенный порошок высушивают при 30-60°С и остаточном давлении 1-10 мм рт.ст. до постоянного веса. Выход целевого продукта 5-15% от веса воздушно-сухих корней, зависит от места сбора сырья и режима обработки (количества экстракции, крепости используемого для экстракции спирта). Полученный эпигалохин представляет собой аморфный порошок .светло-коричневого цвета с характерным запахом, растворимый в воде, этаноле, метаноле, диметилформамиде, диметилсульфоксиде, разлагается при 290-300 С J;+40 (с 1,0, этанол) . ..

При использовании для экстракции ЭТШ10ВОГО спирта крепостью менее

25% наряду с эпигалохином извлекаются гидрофильные балластные вещества (моно- и полисахариды, минеральные соли и т.п.), что затрудняет

очистку целевого продукта.

Экстракция сырья этиловым спиртом крепостью 70% приводит к значительному снижению выхода эпигалохина и увеличению содержания гидрофобных низкомолекулярных балластных веществ в экстракте.

Предпо 1тительно использовать этиловый спирт концентрации 30-40%. При получении целевого продукта

эпигалохина упаривать и сушить практически возможно при любой температуре до . Температура в этих пределах гфактически не влияет на качество и количество получаемого

целевого продукта, а лишь ускоряет процессы упаривания и сушки. Длительное воздействие на препарат температзфой более 60 С приводит к ухудшению фармакологического действия

препарата. Остаточное давление определяется теьшературой сзшки.

Пример 1. В перколятор емкостью 20 л вносят 2000 г воздушносухих мелкоизмельчениых корней родиолы Семенова и шестикратно экстрагируют при комнатной температуре смесью вода - этиловый спирт (25% по объему) порциями по 12, 10, 10, 10, 10, 10 л, каждой порцией в течение 24 ч. Папученные экстракты, хранящиеся в темноте при комнатной температзфе, объединяют и упаривают в роторном испарителе под вакут умом (при остаточном давлении

30 мм рт.ст., который обеспечивается водоструйным насосом) при АО-50 С до 2 л. Сгущенный экстракт обрабатывают этилацетатом (5 раз по 500 мл). Этилацетатные фракции выбрасывают. Экстракт упаривают на водяной бане в фарфоровых чашках. Остаток высушивают под вакузтом в сушильном шкафу (10 мм рт.ст. маслят ный вакуумный насос) при 50-60 С и

измельчают в порошок. Последний

в колбе емкостью 1 л заливают этипацетатом (300 мп) и кипятят на водяной бане с обратным холодильником F течение 15 мин. После охлаждения и

отстаивания этипацетатный раствор спивают. Обработку этиладетатом торяют 3 раза. Затем порошок высушивают в сушильном вакуумном шкафу (1 мм рт.ст.) при 50-60 С до постоя ного веса и исчезновения запаха эти ацетата. Получают 300 г (15% от веса исходного сырья) целевого продукта, представляющего собой аморфньй порошок светло-коричневого цвета (с , этанол), разлагающийся при 290-300 С, ММ 2000-10000. П р и м е р 2. В перколятор емкостью 20 л вносят 2000 г воздушносухих мелкоизмельченных корней роIдйолы Семенова и шестикратно экстра гируют при комнатной температуре 20-25 смесью вода - этиловый спирт (35% по объему) порциями по 12,10, 10, 10, 10 л, каждой порцией в тече ние 24 ч. Полученные экстракты, хра нящиеся в темноте при температуре 20-25°С, объединяют и упаривают в роторном испарителе под вакуумом (30 мм рт.ст.) при 40-50°С до 2 л. Сгущенный экстракт обрабатывают этилацетатом (5 раз по 500 мл) Зтк ацетатные фракции выбрасывают. Экст ракт упаривают на водяной бане в фарфоровьзг чашках. Остаток высушива ют под вакуумом в сушильном шкафу (10 мм рт.ст,) при 50-60 С н измельчают в порошок. Последний в колбе емкостью 1 л заиливают этилацетатом (300 мл) и кипятят на водя ной бане с обратным холодильником 3 течение 15 мин. После охлаждения отстаивания этилацитатный раствор ели вают. Обработку этилацетатом повторяют 3 раза. Затем порошок высушиваю в сушильном вакуумном шкафу при 50-60 С до постоянного веса и исчезновения запаха этилацетата. Получают 200 г (10% от веса исходного сьфья) эпигалохина (целевой продукт) представ-пянядего собой аморфный порошок светло-коричневого цвета с о11.р+4 (с 1jO, этанол), разлагающийся при 2000-10000. 290-300 С, ММ I ПрцмерЗ. В перколятор емкостью 20 л вносят 2000 г воздушносухих мелкоизмельченных корней родиолы Семенова и шестикратно экстрагируют при комнатной температуре смесью вода - этиловый спирт (70% по объему) порциями по 12, 10, 10, 10, 10, to л, каждой порцией в течение 24 ч. Полученные экстракты, хранящиеся в темноте при комнатной температзфе (20-25с), объединяют и упаривают в роторном испарителе под вакуумом (30 мм рт.ст.) при 40-50 С до 2 л. Сгущенный экстракт обрабатывают этилацетатом (5 раз по 500 млХ Этилацетатные фракции выбрасывают. Экстракт упаривают на водяной бане в фарфоровых чашках. Остаток высушивают под вакуумом в сушильном шкафу (10 мм рт.ст.) при 50-60°С и измельчают в порошок. Последний в колбе емкостью 1 л заливают этнлацетатом (300 мл) и кипятят на водяной бане с обратным холодильником в течение 15 мин. После охлаждения и отстаивания этилацетатный раствор сливают. Обработку этилацетатом повторяют 3 раза. Затем порошок в 1сушивают в сушильном вакуумном шкафу , (1 мм рт.ст.) при 50-60 с до постоянного веса к изчезновения запаха этилацетата.Получают 100 г (5% от веса исходного сырья) эпигалохина (целевой продукт), представлякицего собой аморфный порошок светло-коричневого цвета с Со(р 40 (с 1,0, этанол), разлагаюпшйся при 290-300 0. ММ 2000-10000. Эпигалохин является смесью растительных полимеров с различной степенью полимеризации, где п (примеры t-3 получения пигалохина). Структура общей формулы,эпигалохина подтверждена химическими превращениями и данными УФ-, Ж-спектров, сравнеяиен этих данных с данными, полученными при изучении полимера с вьщеленного из самого эпигалохиРазделение полимеров И -2, И-3, -5 не представляется возможным с технической точки зрения. Активность целевого продукта проявляется суммой конденсированных катехинов с различной степенью полимеризации - эпигапохином. Определение молекулярной массы эпигалохина. Молекулярнук массу ММ) устанавливают методом гель-фильтрации на колонке с сефадексом марки Ь Н-20, растворитель и элюеит - смесь диметипформамвд - вода (9:1). Образец берут в вцде О,5%-ного раствора в указанной смеси растворителей и наносят на колонку (143 см) с сефадексом. Скорость элюации 6-7 мл/ч. Фракции собирают по 1 мл, концентрацию вещества в них определяют на спектрофотометре СФ-16 при 278 им. 7 На гель-хроматограмме (элюограмм разграничивают области димеров, три меров, олигомеров и полимеров различной степени полимеризации. Подсчитав площади этих фракций на элюограмме, установили, что соедине ния с ММ меньше 2000, т.е. составляе 6% от cyMMbii соединения с ММ до 5000 - 2,5%; 5100-5900 - 20%; 59006600 - 50%; 6600-7400 - 15%; по 10000 - 3,5% и более 10000 - 3%. Из элюограммы и подсчетов видно, что основную часть суммы составляют полимеры с ММ 5100-7400 (85%). Расщепление эпигалохина. В четьфехгорлую круглодонную кол бу емкостью 50 мл помещают 1,О эпигалохина и 5,Оемкого калия. При постоянном пропускании тока азота и перемешивании нижнюю часть колбы догружают в баню с легкоплавким сплавом при 155-160 С. Температуру поднимают в течение 5 мин до и затем реакционную смесь быстро охлаждают, подкисляют 20%-ноЙ серной кислотой. Содержимое колбы разбавляют водой и экстрагируют этилацетатом (50 Mrt X 5 раз). Этилацетатное извлечение сзпват безводным сульфатом натрия, фильтруют и отгоняют. Остаток хроматографирую т на колонке с полиамидом (элюёнт - смесь хлороформа с метанолом 9:1). Получают следующие соед нения: С , М 126, т.пл. 218219°С, Rf 0,64, CgHgOs-, М 170, т. Ш1. 220 (с разл.) ftiO,56, М 154j т. Ш1. (с раз ложением), R{0,72 (значения веществ определены методом бумажной хроматографии в системе Н 6утанол 85%-ная муравьиная кислота - вода 95:10:20). Ползгченные соединения по физико химическим константам спектральны данным (ИК-, УФ- и масс-спектры) и непосредственным сравнениям с ис пытанньми образцами идентифицирова соответственно с флорог-шоцином, га вой и протокатеховой кислотами. Пр действии соляной кислоты на разбавленный водный раствор эпигалЪхи образуются актоцианидины - цианиди и дельфинйдин. . Выделение полимера с из эп галохина. 30 г эпигалохина смешивают с 20 целлюпозы и помещают в .колонку с 1 целлюлозой (5 X 140 см, 400 г). Элюируют водой, водным этанолом (1:1), этанолом, метанолом, собирая фракции по 20 мп11-45 вода, 46-9.6 (вода-этанол), 91-134 (этанол), 135160 (метанол). Упариванием растворителя из фракций 1-52 и 58-160 получают соединения различной степени полимеризации (в граммах): 0,6t; 5,87, 14,53; 4,50;.0,85; 0,52, процентное соотношение которых совпадает с результатами, полученными гель-фильтрацией. При сгущении фракций 52-57 вьщеляют 1,72 г вещества состава , ММ 1947 (ультрацентрифуга), при 290-300°С разлагается, Ri 0,01 в системе н-бутанол - уксусная кислота - вода (3:1:5) и R{0,54 в этаноле (с 1,0; этанол). Вычислено,%: С 59,16t Н 3,87; О 36,97. Найдено,%: С 59,17 Н 3,86; О 36,97. УФ-спектр:/Й 215, 245, 278, 310 нм (gf 5,43, 4,89j 4,45, 4,7). Спектр снят на спетрофотометре ЕР ЗТ фирма Hitachi (Япония). ИК-спектр: -9 3500-3200, 2935, 1657, 1610, 1535, 1515, 1495, 1440. 1320, 1250, 1200, 1150, 1105, 1040, 1038} 83, 830, 800, 770, 737 см . .Спектр снят на приборе ИК-20 Карл-Цейс-Иена (ГДР). Молекулярная масса и гомогенность определена на ультрацеитрифу ге НОМ 3170 (Венгрия), скорость 8000 об/мин, i , угол ЭО, время 30 мин, 5 1, D 8,410. Спектр ЯМР С снят на спектрометре Varian XL-100 в растворе dе (), внутренний стандарт TMS, сигнал которого принят за О (сГ-шкала). Структура общей формулы эпигалохииа подтверждена химическими превращениями и данньаш УФ; ИКи ЯМР С-спектроскощю для полимера с tl 1. В УФ-спектре имеются максимумы при 220, 240, 310 нм. В ИК-спектре появляются полосы поглощения при 3200-3500 см (колебания гидроксильных групп), 1657 см (Я-ООС-Арил), 1610, 1535, 1515, 1440 см (скелетные колебания ароматического ядра), 1535, 1515, 1150, 1040 и 830, 800, i 770, 737 см (гоюскостные н внештоскостные деформационные колебания 1,3,4- и 1,3,4,5-замещенных аромати ческих колец), 1320, 1200 см (0-Н в фенолах и колебаниях С-0 связи) 1250 1038 (С-0-С-группы),. 1033 (С-0), 1105, 1050 см (С-О-М этерифицированной вторичной ОН-группы) В ЯМР Т-спектре полимера обнаружены резонансные сигналы: при 154157 м,д. (С-9, С-5, С-7 кольца А эпикатехином), 145,9 м.д. (С-3 и С-4) кольца В эпикатехинов, С-3 и С-5 кольца эпигаллокатехина); 133, 9м.д. С-4 кольца В эпигаллокатехина); 131,5 м.д. (C-t кольца В эпикатехинов) при 119,5 м.д. (С-6 кольца В эпикатехина); при 110,7 м (С-2, С-5 эпикатехина и С-2, С-6 эпигаллокатехина), при 166,9, 145,9 121,9 и 110,7 м.д. (соответ. С-, С-3, и С-4, С-5; С-1; С-2 и С-6 остатка галловой кислоты), при 107,7 м.д. (С-6, С-8 и С-10 замещенных колец А эпикатехинов), 105,4 м.д. (верхний конечный С-10, приьажающий к замещенному C-4)i при 100,5; 96,5 и 98,5 м.д. (соответ. С-10, С-8 ,и С-6 конечных А-колец эпикатехинов), 76,8-78,6 (С-2 эпикатехинов), 72,1-75,2 (С-3 эпикатехинов), при 37,9, 27,8 м.д. (cootBeT. С-4 замещенньпс и С-4 конечного эпикатехинов). Распределение фракций с различным молекулярным весом в эпигалохи не установлено методом гель-фильтр ции на сефадексе марки ЬН-20. Фармакологическое исследование эпигалохина. Доза 100 w/кг. Экспериментальны ми животными являлись белые беспоро ,ные мы1ш весом 18-22 г. Представлен ные данные получены на 800 животны Гипоксическая нормобарическая гипоксия вызывалась помещением животных g герметически закрывающийс эксикатор. Препараты вводились вну брюшинно за 30 мин до помещения в эксикатор. Полученные данные показ ли высокую противогипоксическую ак ность эпигалохина на этой модели г поксии. Статистически достоверное УД нение продолжительности жизни мыше начиналось уже с дозы 1 мг/кг. В д 10мг/кг продолжительность жизни мьппей, получивших эпигалохин, сост вила 156% к контрольной группе, в дозе 20 мг/кг - 165% и дозе 40 мг/кг 207%. Противогипоксическая активность гутамина оказалась значительно слабее: в оптимальной дозе 100 мг/кг он удлинил жизнь животных на 145%, т.е. меньше, чем эпигалохина в дозе 10мг/кг, т.е. эпигалохин значительно активнее гутимина по защитному действию при гипоксической нормобарической гипоксии. Гипоксическая гипобарическая гипок сия создавалась в барокамере. Животные поднимались до высоты 11 км со скоростью 1 км/мин. На высоте 11км мыши наблюдались в течение 45 мин. Животные, преодолевшие этот временной барьер, считались выжившими. Препараты вводились за 30 мин до помещения мышей в барокамеру. Эпигалохин проявляют высокую противогипоксическуто активность и на этой модели гипоксии. В дозе 20 мг/кг (внутрибрюшинно) он предохраняет гибели 60% животных (в контрольной группе все мьщш погибли за 3,2-0,58 мин) и статистически достоверно удлинил продолжительность жизни на 92,5% по отношению к контролю. Активность гутимина была меньшей: в дозе 100 мг/кг (внутрибрюшинно) он удлинил продолжительность жизни животных на 650% и не предохранил от гибели ни одного животное. Таким образом, эпигалохин превосходит гутимин по защитному действию от гипоксической гипоксии. Цитотоксическая гипоксия вызьгаалась подкожным введением цианистого натрия в дозе 8 мг/кг. Препараты вводи/шсь внутрибрюшинно за 30 мин до инъекции цианистого натрия. Эпигалохин в дозе 40 мг/кг статистически достоверно удлинил продолжительность жизни животных в 5,74 раза Действие гутимина бьшЬ значительно слабее: в дозе 100 мг/кг он удлинил продолжительность жизни лишь в 3 раза. Эпигалохин превосходит гутимин по защитному действию от цитотоксической гипоксии.. Гемическая гипоксия вызывалась внутрибрюшинным введением нитрита натрия в дозе 160 мг/кг. Препараты вводились на 30 мин до инъекции нитрита натрия, внутрибрюшинно. В контрольной группе погибли все животные. Эпигалохин в дозе 20 мг/кг предохранил от гибели 17% мышей

и на 157% удлинил продолжительность j жизни остальных животньпс. Гутимин не1 только не проявил защитного эффекта, а статически достоверно уменьшил время их жизни в 2 раза по сравнению с контролем.

Эпигалохин оказывает защитное действие от гемической гипоксии в отличие от гутимина, утсудшающего её течение.

Изучение общего действия и токсичности эпигалохина показало, что при внутриврюшиннсш введении вещество не вызывает изменений в поведении животных до дозы 50 мг/кг, от которой наступает небольшое уменьшение спонтанной двигательной актив, мости и уреже1 ие дыхания. С увеличением дозы эти явления становятся . более вьфажеиными, животные группируются пояйляется птоз и расслабление шейных мышц. Спонтанные движения почти отсутствуют, однако на звуковое и болевое раздражение животные реагируют писком и реакцией,идбегания. рассчитанная по feipeHcy, составляет 325 мг/кг. При введении внутрь действие препарата аналогично но начальная угнетающая доза составляет 200 мг/кг, а Щуо по Беренсу - 833 мг/кг. Следовательно, широта фармакологического действия эпигалохина при внутрибрюшинном введении в оптимальной дозе (20 мг/кг) составляет 16,2, ГУ И

при подкожном введении составляет 1325 мг/кг, т.е. широта фармакологического действия для оптимальной дозы 100 мг/кг составляет 13,2.

Таким образом эпигалохни превосходит гутимин по широте фармакологического действия.