Способ определения активности тромбина Советский патент 1985 года по МПК G01N33/48 A61B10/00 

а

00 ч

00 Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в диагностике нарушений системы све тывания крови. Цель изобретения - повышение спе цифичности анализа активности тромбина. Сущность изобретения заключается в следующем. В качестве субстрата для определ ния активности тромбина применяется раствор дансилированного фибриногена. Дансилирование фибриногенаосуществляется по методу, сущность которого заключается в том, что аминогруппы фибриногена реагируют с флюоресцентным красителем Дансилхлоридом в щелочной среде с образов нием ковалентной свяёи. Под влиянием тромбина от молекул дансилированпог фибриногена отщепляются флюоресцент но-меченные низкомолекулярные фибринопептиды А и В. После осаждения белков из реакционной смеси 30%-ной трихлоруксусной кислотой количество фибринопептидов в надосадке определяется флюориметрически. При определении количества тромбина в биологических жидкостях на результаты определения не отража™ ется наличие в Hjix других нивкомолекулярных пептидов ввиду отсутствия флюоресцентной метки у последних . Примеры конкретного применения способа. Пример 1.0 Определение актив ности, тромбина в модельной системе По 2 мл раствора дансилированного фибриногена разливали в А пробирки. В каждую пробирку добавляли по 0,1 мл раствора тромбина в следующих соотношениях; 1 s 11 1.г2; 1:А| 1:8. Через 15 мин реакцию преры вали добавлением 2,0 мл 30%-ной ТХУ ки лоты. Пробы центрифугировали 10 мин пр 1300 о . Надосадочную жидкость флюориметрировали на микрофлюориметре Fica-55. Длина волны возбуждення флюоресценции 365 нм; длина волны регистрации флюоресценции 520 нм. В контроле к 2,0 мл фибриногенар добавляли 0,1 мл 0,9%-ного раствора NaCl, Данные приведены в табл. 1. Результаты выражены в единицах относительной активности. Активность тромбина рассчитывают по формуле -г.( -f п / где OQ и О )j - интенсивность флюоресценции опытной и контрольной проб; h - степень усиления прибора; К - коэффициент пропорциональности, рассчитываемый экспериментально для конкретного типа флюориметра путем деления интенсивности флюоресценции опытной пробы на количество единиц активности тромбина в пробе. Пример 2. В 4-х пробах к 0,5 мл исследуемой цитратной плазмы добавляли 1,5 мл раствора дансилированного фибриногена, содержащего 105-2-1 мг белка. Для рекальдификации вносили мл 1,28%-ного раствора хлористого кальция. Через 15 мир реакцию прерывали добавлением 2,0 мл 30%-ного раствора ТХУ кислоты. В контроле вместо раствора хлористого каль ция добавляли 0,1 мл 0,9%-ного раствора NaCl. Пробы центрифугировали 10 мин при 1300 , Надосадочкую жидкость флюориметрировали на микрофлюориметре Fica-55, длина волны возбуждения 365 нм, длина волны регистрации флюоресценции 520 нм.Результаты выражали в единицах относи- : тельной флюоресценции (табл. 2). Сравнение этих данных с результатами примера 1 показьгаает, что активность тромбина в пробах плазмы бьша низкоЙ5, соответствуя большим разведениям тромбина (1:8 - 1:16), вызывая однако достаточную рабочую интенсивность флюоресценции фибринопептидов при установке чувствительности прибора на среднюю степень. I Пример 3, С целью сравнения чувствительности определения белка и его дериватов методами Лоури и предлагаемым способом (флюориметрически) проведены следующие исследования. Приготовлены разведения дансилированного -фибриногена, содержащие в пробе от 2800 до 0,14 мкг белка Производили определение белка в пробах по методу Лоури и флюориметрически на микрофлюориметре Fica- SS при длине волны возбуждения флюоресценции 365 нм и длине волны регистрации 520 нм. Полученные данные представлены в табл. 3. П р и м е р Д. Тромбин-фибриногеновая реакция поставлена в следующей системе, К 2,0 мл 0,5%-ного раствора даксилированного фибриногена добавлено 2,0 мл 40%-ного раст вора мочевины и 0,2 мл раствора тромбина с активностью 10 с. Пробу инкубировали при 90 мин. После инкубации в пробу для осаждения фибриномономеров и тромбина добавля ли 2,0 мл 8%-ного раствора хлорной кислоты. Пробу центрифугировали 15 мин, при 8000 обм/мино Надосадочную жидкость, содержащую фибрииопептиды А и Bf отсасывали и корректировали ее до 7,5 с добавлением 0,12 мл 10%-ного раствора КОН., Солевой осадок удаляли повторным центрифугированием в том же режиме. Готовили разведения фибринопептидов А и В на физиологическом растворе в 3, 12 и 120 раз, анализ проб осуществляли н тодом Лоури как в прототипе и флюориметрическИ;, как в предлагаемом способе Выход фибринопептидов А и В составил порядка 1:60 от веса взятого фибриногена, что совпадает с извест ными данными теоретического анализа Таким образом, полученные данные показали, что для успешного примене ния метода Лоури для клинического, определения фибринопептидов А и В как специфических показателей актив ности тромбина в тромбин-фибриногеиной реакции их содержание в пробе должно быть вьше 10 мкг (табл. 2а 3), что совпадает с извес ными даннь ми литературы. Флюориметрический анализ позволя увеличить чувствительность способа на 10. Столь значительное повышение чувст вительности способа и приведенные данные показывают, что содержание дансилировакного фибриногеб«а в проб в зависимости от активности тромбин может колебаться в значительных пределах (6-6x10 мкг)„ Однако опти мальные колебания содержания данси7S4лировэнного фибриногена в пробе, ориентированные с одной стороны на низкие значения тромбиновой активности, а С другой - на рациональное расходование реагента (как показывают примеры 1 и 2) составляют 2-5 мг. При этом создается возможность анализа активности тромбина по уровню отщепляемых им от фибриногена фибринопепгидов А и В не только в модельных системах (как в прототипе), но и в биологических образцах (плазма сыворотка), Пример5, С целью выявления специфичности метки А и В пептидов фибриногена различными флюоресцентными зондами в технике предлагаемого способа были применены препараты фибриногена, меченного аналинонафталинсульфонатом магния (АНС), флюорескамином (ФК) и диметнламинонафтапиксульфонилхлоридом (дне), являющиеся одним из относительно широко применяемых флюоресцентных зондов. 5 параллельных исследованиях в модели применялись растворы тромбина (г Каунас) с пропорционально снижающейся активностью (40, 20 и to ед,). Ланные флюоресцентного свечения фибринопептидов А и В в ана логичных системах опытов (фпюориметр Хиттачи, Япония) представлены втабл, 4, Прицер 6. К мл исследуемой цифтратной плазмы добавляли 1,5 мл 1%-ного раствора дансилированного фибриногена..Для рекальцификации внесено 0,1 мл 1 28%-ного раствора хлористого кальция. Через 15 мня реакцию прерьюали добавлением 2,0 мл 30%-кого раствора ТХУ кислоты. В контроле вместо раствору хлористого кальция добавляхш 0,1 мл 0, раствора NaCl. Пробы центрифугировали 10 мин при 1300, : Надосадочную жидкость флюорнметрировали на флюорИМЁ ре Fica-55, длина долны воэбузд ния 365 нм, длина волны регисградш; 520 им. Результаты выражены в единицах относительной флюоресценции: контроль 3 ед, проба - 18 ед.

Зависимость флюоресценции фибринопептидов от количества дансилированного фибриногена в пробе

Таблица 1

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ТРОМБИНА путем взаимодействия с фибриногеном и последующим определением его активности по уровню фибринопепгидов А и В в опытной и контрольной пробах , отличающийс я тем, что, с целью повьшения специфичности определения, в исследуемую пробу дополнительно вводят фибриноген, обработанный 5-диметиламиносульфанилхлоридом в конечной концентрации 2-5 мг/мл далее определяют интенсивность флюоресценции в исследуемом растворе после отделения , фибрина, а активность тромбина ( ) определяют по формуле где Од и 3 интенсивность флюоресценции опытной и контрольной пробы;, степень усиления флюМ ориметра; К коэффициент, равный отношению величины ел интенсивности флюоресценции к активности тромбина в стандартной пробе.

Интенсивность

62 флюоресценции

Количество дансилилированного фибрино10гена в пробе, мг

Сравнительные данные чувствительности метода Лоури и флюоресцентного анализа при определении белка

Больше Больше 0,48

Энстанкция по Лоурй шкалы шкалы ФЭК ФЭК Флюоресценция, усл.ед. 200 120

82,2

15

Таблица 2

Таблица 3

О О 26 3,2 3,2 1,4

Результаты определения активности тромбина по технике предлагаемого способа с применением фибриногена, меченного различными флюоресцентными зондами (усл.ед). АНС 1,4.. ФК 4,74,1 дне 16,29,0

Таблица 4 1, 4,1 , - 4,7