Способ определения фибринолитической активности препарата стрептокиназы Советский патент 1986 года по МПК C12N9/70 C12Q3/00 C12Q1/56 C12N9/70 C12R1/46 

Изобретение относится к прикладно микробиологии и может быть использовано для контроля полуфабрикатов и препаратов стрептокиназы медицинского и ветеринарного назначения.

Цель изобретения - повышение точности способа и снижение ei o трудоемкости.

В основе предлагаемого способа лежит установленная закономерность заключающаяся в пропорциональности измеряемого значения фибринолити- ческой активности и концентрации коагулируемого белка. Кроме- того, установлен трансцендентный характер зависимости времени лизиса фибрино- вого сгустка от разведения стрептокиназы, что отражено введением по- казателя степени для множителя, показывающего, во сколько раз фактическое Время лизиса отличается от 30 мин, т.е. от времени лизиса сгустка одной единицей фибринолити- ческой активности стрептокиназы. Эта зависимость получена путем обработки более 500 анализов и характеризуется корреляционным отношением 0,99, что свидетельствует о том, что положенная в. основу измерений закономерность является практически строго функциональной.

При 37°С лизис фибринового сгустка наступает при наибольшем разведении контролируемого препарата (при прочих .равных условиях). Из этого следует два практических вывода:

наибольшая точйЬсть измерений дос тигается в точке экстремума,. т.е. при термостатировании реакционной смеси при , поскольку в точке экстремума влияние помехи минимально;

поскольку при проведении анализов установка задания по температуре не представляет сложности, имеет смысл работать только в наиболее предпочтительном режиме, т.е. при .

При использовании этой температуры расчет ведут согласно выражению

Г 0,087 f(2-2)

(3)

Реакцию фибринрлиза удобно проводить в термостате с прозрачной стенкой типа ТИС, где осуществляется водяной подогрев проб, внесенных в про.бирки Уленгута, В таком случае для нормального заполнения пробирок реакционную смесь можно готовить из расчета 0,2 мл разведения стрептокинаяы на 1 мл раствора фибриногена (это соотношение ингредиентов имеется и известном способе), т.е. при С 0,2. В данном случае (при Т 37 С) выражение (3), в свою очередь, упрощается и принимает вид

Чл j Y 0,435 Ах () . (4)

В табл. 1 представлены результаты

измерения фибринолитической активности лечебной стрептокиназы (препарат, действуюш 1М началом которого является стрептокиназа) при различной температуре термо статирования реакционной смеси и .следующих адекватных условиях анализов: С 0,2; х , 0,58 мг/мл; активность тромбина 2,0 ед. В табл. 1 показаны три серии измерений, каждая из которых включает по четыре пробы с разными разведениями стрептокиназы.

В связи с тем, что в предлагаемом способе учитываются все пробы, в табл. 1 дана статистическая характеристика результато в измерений в виде средних значений Y и среднеквадрати- ческих отклонений (СКР). Для учета реакции по известному способу статистическая оценка не дается, так

как ;7читывают реакцию лишь в двух пробирках, что при двух определяемых операндах формулы дает число степеней свободы f. О.

Как видно из табл. 1 результаты определения по формуле Коникова не только резко отличаются от получаемых величин в ME на 1 мл по номиналам,но и по влиянию на них температуры (в известном спсГсобе на 17,9- 28,5%, в предлагаемом на 3,3-4,1%). При этом результатов измерений фибринолитической активности при различных температурах в предлагаемом спосо бе при 5%-ном уровне значимости статистически не значимы.

Влияние активности тромбина на результаты определения фибринолитической активности препарата стрептокиназы (,2; С; ,0 мг/мл) приведено в табл, 2.. .

Данные табл. 2 иллюстрируют влияние содержания тромбина на результаты определения фибринолитической активности одного и того же препарата стрептокйн азы при прочих адекватньпс

услов иях (С 0,2; Т 37°С; х

5,0 мг/мл). Статистическая обработка этих, а также других результатов (проанализировано 60 измерений} по

3, 1

казывает, что при р 0,05 результаты измерений при активности тромбина ),5 - 4,0 ед. различаются незначимо. Вместе с тем, точность измерений при содержании тромбина 1,5 ед. значител но ниже, чем в диапазоне 2,0 - 4,0 ед что -видно, в частности, из графы СКО При оптимальном содержании тромбина, равном 3,0 ед., среднеквадратическая ошибка измерений минимальна. Увели- чивать содержание тромбина свыше 4,0 ед. нецелесообразно как по сообржениям точности анализа, так и экономного расходования тромбина.

Несмотря на отсутствие значимых различий,, данные табл.2 при содержаНИИ тромбина 2,0; 3,0 и 4,0 ед. проанализированы методом корреляционного анализа (данные, при 1,5 ед. тромбина не учитывались). При этом коэффициент линейной корреляции равен 0,58, что свидетельствует о слабой корреляционной связи рассматриваемого фактора с результатами измерений . Поскольку предложен метрологи- ческий способ, имеет смысл проводить измерения лишь при оптимальном режиме, характеризуемом использованием 3,0 ед. тромбина. .

В табл. 3 приведены результаты определения фибринолитической активности эталонного препарата стрепто- киназы, содержащего 250 тыс. МЕ/мл (измерения проведены при Т С 0,2; 3,0 ед. тромбина в различны концентрациях коагулируемого белка). В табл. 3 для сравнения приведены результаты контроля, полученные по известному способу. Для оценки результатов используют выражение (4). Значения фибринолитической активное- ти, определенные предлагаемым способом, подвергнуты статистической обработке, а для значений, полученных известным способом, приведены только их величины, так как последние результаты не относятся к известному способу (в нем. не предусмотрена one рация установления концентрации коагулируемого белка), а лишь дают представление о невозможности учета результатов в данном случае.

При технической реализации предлагаемого способа применяют следующие, воспроизведенные в -примере 1, мето- дики определения и установления концентрации ингредиентов реакционной смеси:

; 10 1520 5 .

5

0

224

определение активности тромбина по В.ФС 42-180-72;

.определение концентрации коагулируемого белка по Бидвелл.

Результаты контроля эталонного пре парата стрептокиназы активностью 250 тыс. МЕ/мл приведены в табл.3.

Пример. Операция 1. Приготовление фибриногена.

Питратную кровь донора центрифугируют в течение .0 мин при и факторе разделения F-2000. Плазму от- сасьшают и вливают в охлажденный до 0°С насыщенный раствор хлористого натрия.из расчета 100 мл плазмы на 200 мл раствора хлористого натрия. Смесь встряхивают и выдерживают при -12 С в течение 2 ч, после чего осадок отделяют центрифугированием и растворяют в.0,5%-ном растворе лимоннокислого натрия, объем которого равен I/IO исходного объема плазмы. Раствор подвергают диализу в течение 24 ч при З С против 100-кратного объема 0,5%-ного раствора лимоннокислого натрия, осветляют цент-, рифугированием и лиофилизируют.

Операция 2. Определение коагулируемого белка по Бидвелл.

К 0,2 мл пробы испытуемого раствора фибриногена добавляют 4,8 мл мединалового буфера рН 7,4 и 0,1 мл тромбина. Данную смесь те рмостати- руют при 37 С в течение 1 ч, после чего образовавшийся сгусток промывают охлажденным до 8 С 6,85%-ным раствором хлористого натрия, отжимают жидкость на фильтровальной бумаге и. переносят осадок в пробирки с 2 мл 0,1 М раствора едкого натра. Пробирки кипятят до полного растворения сгустка (в течение примерно 100 мин), охлаждают до комнатной температуры и добавляют в них по 6 мл 12,5%-ного раствора углекислого натрия, 1 мл 0,01 М раствора сульфата меди, перемешивают, а затем через 10 мин вносят по 1 мл разбавленного 1:1 дистиллированной водой раствора Фолина-Чи- калтеу.

Че рез 30 мин производят спектро- фотометрирование приготовленнь Х препаратов при длине волны 750 нм, результаты измерений усредняют (по всем пробиркам) при этом устанавливают содержимое коагулируемого белка путем сравнения результата спектрофотометрирования испытуемых образцов с градуировочной кривой, построенной предварительно для раство- . ров с известной концентрацией белка.

Операция 3. Стандартизация раст- вора фибриногена.

Исходя из содержания коагулируемого белка в препарате фибриногена, определенного на предыдущей опера- ции, содержимое ампулы с лиофилизи- рованным фибриногеном серии растворяют в таком объеме 0,06 М фосфатного буфера рН 7,4 - 7,6, чтобы кон-, центрация коагулируемого белка в . растворе, фибриногена составила 0,04- 0,6 мас.%.

Готовят следующий ряд растворов фибриногена по содержанию коагулируемого белка: 0,04 ; 0,058, 0,1;, 0,25; 0,4; О,5,и 0,6 мас.%.

Операция 4. Определение активност тромбина по ВФС 42-180-72.

В водяной термостат при 37 С помещают сухие агглютинационные пробир- ки, в которые наливают по 1 мл свежей цитратной плазмы и выдерживают 2-3 мин. Затем к плазме приливают 1 ,мл препарата тромбина. Учитывают время образования сгустка. Если сгус ток образовался, ранее чем за 30 с, исходный райтвор тромбина разбавляют до тех пор, пока не будет образовываться сгусток за 30 с. Разведение при котором время образования сгустка равно 30 с, соответствует 1 ед. активности тромбийа.

Операция 5. Стандартизация тромбина.

В соответствии с результатами.

полученными на предыдущей операции.

,

тромбин разводят 0,85%-ным растворо хлористого натрия таким образом, чтобы в 0,1 мл раствора содержалось 2,0 - 4,0 ед. активности тромбина В примере берут разведение с актив ностью тромбина 3,0 ед.

Операция 6, Постановка реакции фибринолиза.

Для растворения контролируемого препарата стрептокиназы готовят 0,06 М фосфатный буферный раствор рН 7,4 - 7,6, содержащий стабилизатор (0,3 мас.% желатины). Этот буферный раствор получают смешением следующих ингредиентов, мл:

0,158 М , 80 0,158 М КНгРО/1 20

j

5

0

5

5

0

5

5

0

0,5%--11ый раствор желатины 150

Для предотвращения бактериального загрязнения к буферному раствору добавляют мертиолят натрия в концентрации 1:1000000. Указанная пропись является типовым растворителем стрептокиназы. Его фильтруют через бумажный фильтр и хранят при 2- . Раствор годен в течение 1 мес.

Содержимое ампулы с лиофилизирэ- ванным препаратом стрептокиназы, подлежащим контролю, растворяют в 1 мл приготовленного фосфатного буфера. Из этого раствора готовят путем последующего разведения тем же буфером испытуемые образцы препарата,-При ЭТОМ разведения выбирают в зависимости от ожидаемой активности препарата.

В агглютинационные пробирки вносят по 0,2 мл исследуемых разведений (Стрептокиназы, по 1 мл раствора фибриногена из указанного в описании операции 3 ряда и по 1. мл тромбина с установленной при выполнении операции 5 активностью. Таким образом, учитываемые характеристики реакционной смеси составляют: С 0,2; активность тромбина 3,0 ед., концентрация коагулИруейого белка из ряда 0,4; 0,58; 1,0; 2,5; 4,0; 5,0; 6,0 мг/мл.

Реакционные смеси встряхивают, через 15-20 с проверяют наличие образовавшегося фибринового сгустка осторожным наклоном пробирок и помещают в водяной термостат с прозрачной стенкой (для визуального наблюдения за ходом реакции) при 37 С. Для каждой пробирки измеряют время,, в течение которого произойдет лизис сгустка. При этом об йкончании реакции судят по подъему мелких пузырьков воздуха, появляющихся в сгустке фибрина при нагревании.

Фибринолитическую активность контролируемого препарата рассчитыв а- ют На основании исходных данньпс и выявленного времени лизиса по выражению (4 ) .

Результаты определения фибрино- литиче.ской активности приведены в табл. 4 ,

Поскольку в данном примере анализируют разведения одной пробы препарата, определяют среднее значение фибринолитической активности, которое приведено в табл.4 для каждой концентрации коагулируемого белка, а также для всей серии анализов. В результате установлена концентрация стрептокиназы в пробе 14,2 тыс. МЕ/мл,. СКО 1 ,15.

Пример 2. Препарат стрептокиназы контролируют, как описано в примере 1, при следующих характеристиках испытания: С 0,4; Т 40 С; X 0,63 мг/мл.

Подставляя значения указанных параметр эв в выражение (1) , его преобразуют к виду

,137A.l,36.(30/t)

0,1863-A (30/t)

ZS

и учитывают результаты реакции фибри нолиза.

В данном примере для четырех разведений контролируемой пробы стрептокиназы ставят по четыре параллельные реакции. В расчет берут время лизиса по соответствующим параллельным опыта. Далее по выражению (5) рассчитывают фибринолитическую ак-г тивность и СКО для каждого разведения стрептокиназы, а затем для всех проведенных испытаний.

Результаты определения фибринолитической активности приведены в табл. 5.

Пример 3. Контроль фибринолитической активности культураль- ной жидкости стрептококка.

Культуральную взвесь Streptococcu equisimilis шт. 921/18 освобождают от микробной массы фильтрованием через бумажный фильтр, 0,1 мл разведенной полученной культуральной жидкости используют для постановки реакции фибринолиз а, которую проводят, как описано в примере 1. Условия проведения реакции: С 0,1; Т 36°С; X 1,0 мг/мл.

Подставляя условия проведения реакции в выр ажение, последнее преобразуют к виду

Y о, 87 г 1,04(30/Г:) 0,905(30/t)

(6)

Результаты реакции, рассчитанные по выражению (6), приведены в табл.6.

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет повысить точность и снизить трудоемкость определения фибринолитической активности препаратов стрептокиназы. Уменьшение трудоемкости обеспечивается тем, что отпадает необходимость в постановке параллельных проб в окрестности учитывавшихся в известном способе разведений контролируемой пробы.

20

s

25

30

Учет реакции ведется по всем анализируемым разведениям стрептокиназы, что является одним из факторов, обеспечивающих повьппениа точности способа. Другим фактором повышения точности контроля в предлагаемом способе является учет параметров, влияющих на оценку результата, и прежде всего концентрации коагулируемого белка в растворе фибриногена. О влиянии этого параметра на точность измерений можно судить из сопоставления данных третьей и шестой колонок табл. 3, из которых видно, что при различном содержании коагулируемого

35 белка реакции предлагаемый способ дает близкие результаты (средняя ошибка 2%, максимальная ошибка 6,7%) тогда как учет результатов соответствующих реакций по известной форму40 ле дает значения, сильно отличающиеся одно от другого (.(от 498,7 до- 4851,5 тыс. ед. Коникова/мл).

Преимуществом предлагаемого спосо- 45 ба является его стандартизация, т.е. обеспечение возможности изменения фибринолитической активности стрептокиназы в международных единицах, тогда как в известном 50 способе измерения ведутся в не сопоставимых с ними единицах Коникова.

35

243,8 17,9

37

297,1

212,3 28,5 (известный способ)

30 50 100

22,3 34j5 59,7

14,7

3,9 3,3

15,2

0,5

15,6

.0,2 4,1

Таблица 2

10614,1 15,35 0,86

301315,5

501915 ,8

10032 -16,0

10 .814,1 14,87 0,67

3017,515,3

502615,2

5 . .714,4 . 14,83 0,84

101214,3

. 201915,8

1414,9 13,5 1,21.

310,312,8

515,512,8

315,512,3 13,2 0,9.6

5 .2213,0

103514,2 .

1714,4 13,6 0,86

3 ,1812,7

5V2513,8

1 .8 14,6 13,6 1,05

319,513,7

5 , 3112,5

л

Среднее значение14,2 1,15

Таблица 4

15

Редактор В.Петраш

Составитель В.Голимбет Техред О.Сопко

Заказ 3668/26

Тираж 490Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул.Проектная,4

1242522

16

Таблица 5

Таблица 6

Корректор С.Черни