Способ определения количества инфузорий Советский патент 1985 года по МПК C12M3/00 

,, Изобретение относится к биологии и может быть использовано при определении биологической ценности продуктов и кормов. Известен способ определения количества инфузорий путем их подсчета, предусматривающий предварительное введение в анализируемую пробу субст рата реагента Недостатки этого способа - низкая точность, длительность, трудоемкость. Целью изобретения является повьше ние точности. , Поставленная цель достигается тем что согласно способу определения количества инфузорий путем их подсчета, предусматривающему предварительное введение в анализируемую пробу субстрата реагента, перед подсчетом анализируемую пробу субстрата с реагентом перемешивают с последуюпшм центрифугированием в течение 1520 мин при 1-2 тыс.об/мин и отстаивают 30-60 мин, при этом в качестве реагента используют 0,4-0,6%-ный раствор хлористого натрия рН 7,17,3, а определение количества инфузо рий осуществляют путем их автоматического подсчета в надосадочной жидкости. Особенно важным в определении биологической ценности продуктов с использованием тест-объекта инфузорий является установление степени влияния этого продукта на жизнедеятельность инфузорий . Наличие какихлибо нежелательных веществ в продук те или низкая усвояемость белков продукта сказывается на росте и развитии инфузорий, чтопроявляется в виде, замедления роста, снижения активности ее движения, зплоть до .гибели инфузорий. Поэтому, определяя качество продукта, .прежде всего ориентируются на количество живых, активных инфузорий. Согласно суще. ствующему методу подсчета количеств инфузорий в камере Фукс-Розенталя их фиксируют раствором формалина ил другого вещества (т.е. их убивают) и все имеющиеся инфузории, не исклю чая ранее погибших, подсчитывают. При осуществлении предлагаемого способа определяют количество тольк живых инфузорий, что, в свою очеред дает возможность более точно устана ивать биологическую ценность продуктов животноводства и кормов. Использование счетчика микрочастиц Пикоскеля значительно сокращает время определения, но без предварительной подготовки пробы проведение способа и получение точных результаг тов невозможно из-за закупорки измерительного капилляра прибора. Концентрация раствора хлористого атрия, время, скорость центрифугирования и другие параметры подобраны экспериментальным путем. На фиг. 1 показан график зависи- мости влияния концентрации хлористого натрия на активность инфузорий Тетрахимена пириформис; на фиг. 2 - граijMK зависимости концентрации водородных ионов (рН) среды на активность ийфузорий 1етрахимена пириформис; на фиг. 3 - влияние р,ежимов центрифугирования на активность инфузорий , Тетрахимена пириформис. Способ заключается в следующем: 1мл питательной среды с выросшими инфузориями разводят 50 мл 0,40,6%-ным раствором хлористого натрия (рН 7,1-7,3), тщательно смешивают и центрифугируют 15-20 мин при 12тыс.об/мин. При этом механические частички, погибшие и частично живые инфузории осаждаются. Содержимое центрифужных пробирок отстаивают 30-60 мин. За это время живые инфузории поднимаются в надосадочную жидкость. Далее осторожно берут 15-20 мл надосадочной жидкости, вносят в стаканчик и производят подсчет на счетчике микрочастиц Пикоскеля. При этом способе инфузории не фиксирзтот. Расчет полученного результата осуществляют по формуле Н L Е V . где п - количество инфузорий в 1 мл; L - коэффициент деления счетчика;Е - результат счета на цифровом ;индикаторном табло; Н - коэффициент разбавления; V - измерительный объем прибора (для Пискокеля 0,378), Предварительная подготовка пробы, предусматривающая разведение испытуемого субстрата 0,4-0,6%-ным раствором хлористого натрия рН 7,1-7,3 с последующим тщательным перемегаиванием,

3

обуславливает сохранение максимальной биологической активности инфузорий Тетрахимёна пириформис. Кроме того, отделение испытуемых продукто от вьфосших инфузорий путем центрифугирования в течение 15-20 мин при 1-2 тыс.об/мин с последующим отстаиванием 30-60 мин, отбором 15-20 мин надосадочной жидкости со всплывшими инфузориями для целлоскопического счета позволяет получить точный достоверный результат. Поскольку в определенных пррдуктах и кормах могут присутствовать те или иные токсические агенты становится очевидным, что погибшие в результате этого инфузории являются фоном, затрудняющим дать,-Достоверную оценку. Поэтому, учитывая живые, активные инфузории и исключая погибшие, исследователь получает возможность да наиболее объективное заключение по качеству испытуемого продукта в, сравнении с контрольным продуктом или стандартом.

Приме р. Необходимо выбрать наиболее рациональную технологию изготовления корейки. Корейка № 1 созревание при корейка t 2 созревание при 15-18°С; корейка № 3 - созревание при 40-43°С; контроль - созревание при 0-3°С.

Этот вопрос решают путем определения биологической ценности на тест-объекте инфузории Тетрахимёна пириформис.

Берут 4 навески 0,9; 0,6; 0,3 и 0,15 мг/мл, вносят в питательную среду, выращивают согласно известно методики и подсчитывают известным и предлагаемыми способами.

В первом случае исполнитель за-правляет камеру Фукса-Розенталя и под микроскопом считает инфузории в 10 квадратах. Всего необходимо подсчитать 4 пробы х 4 разведения 16 проб (160 квадратов).

Для получения достоверных-результатов необходимо опыт провести в 3 повторностях, проб (480 квадратов). Для подсчета 48 проб необходимо 7-8 ч.

у

Согласно предлагаемому исследуемые пробы разводят раствором хлорис54

того натрия, смешивают и центрифугируют (30-40 мин) отстаивают (3060 мин). Подсчет на счетчике микрочастиц 48 проб 15-20 мин. Таким образом, один человек свободно может за день исследовать 90100 проб.

Непроизводительные затраты времени (переход от центрифуги до счетчика микрочастиц, заправка стаканчиков и т.д.) 20-30 мин. Итого 90-150 мин. Полученные результаты приведены в таблице.

Следовательно, наиболее рациональной является технология, по которой изготавливают корейку № 2.

Проведенные исследования по изучению активности инф зорий в зависимости от концентрации хлористого натрия (4иг. 1) позволяют судить о том, что наиболее желательной является концентрация 0,4-0,6%. Удовлетворительная активность сохраняется

до концентрации 0,9%, а концентрация вьш1е 1,2% является для инфузорий губительной.

Концентрация ионов водорода (рН) среды (фиг. 2) имеет пик активности

для инфузории в пределах 7,1-7,3. Среда. рН ниже 5 вызывает резкуюатаксию инфузорий. Изменение рН среды в щелочную сторону является удовлетворительной до рН 8,0, после

чего крайне снижается активность, появляются атипичные формы инфузорий.

Появление атипичных форм также указывает на отрицатед.ьное действие

запредельных параметров среды. Это обстоятельство учитывают при отработе различных параметров способа.

Центрифугирование взвеси инфузорий при 1-2 тыс.об/мин не оказывает

отрицательного воздействия на активность инфузорий (фиг. 3}.

Таким образом, предлагаемый способ является более точным, достоверным, быст1Яз1м и менее трудоемким по сравнению с известным камерным способом подсчета количества инфузорий, т.е. повышает эффективность методор токсико-биологической оценки.

3,9-10

19041184,0-10

24301304,4-10 4,3-10 2,7-10

883812,6-10

9311003,2-10

1952125

2486137

85081

902100

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА ИНФУЗОРИЙ путем их подсчета, 50 предусматривающий предварительное введение в анализируемую пробу субстрата реагента, отлич ающийс я тем, что, с целью повышения точности, перед подсчетом анализируемую пробу субстрата с реагентом перемешивают с последующим центрифугированием в течение 15-20 мин при 1-2 тыс. об/мин и отстаивают 30-60 мин, при этом в качестве реагента используют 4,0-0,6%-ный раствор хлористого натрия рН 7,1-7,3, а определение количества инфузорий осуществляют путем их автоматического подсчета в надосадочной жидкости . (Л а 30 20 1 ./ ff,2 ЯЗ ft 0,5 0,6 0.7 0,3 0,9 -t- w и J,Z %Naa 0UZ.1

5Q ЧП

W

I 2Н

I ч:;

5,0

в. О

го 8,0

Ю.О pHcpeffbi Фиг.2