СПОСОБ ВЫРАЩИВАНИЯ КУЛЬТУР КЛЕТОК Советский патент 1994 года по МПК C12N5/02 

Изобретение относится к медицинской промышленности и сельскому хозяйству, а именно к биологической промышленности, и может быть использовано при выращивании клеточных культур.

Целью изобретения является повышение производительности способа выращивания культур клеток и удешевление его путем выращивания их на микроносителе, в качестве которого используют волокна из стекла диаметром 5-45 мкм при плотности волокон в питательной среде 2-40 г/л.

Экспериментальным и теоретическим обоснованием и предпосылками для выбора параметров процесса были данные, установленные опытным путем.

Диаметр волокон менее 5 мкм соизмерим с диаметром клеток (5-10 мкм), что затрудняет их прикрепление и рост на волокнах.

Стеклянные волокна с диаметром более 45 мкм недостаточно эластичны. Они хрупкие и разрушаются при подготовке и внесении волокон в питательную среду.

Плотность волокон в питательной среде менее 2 г/л не дает достаточно развитую поверхность для прикрепления и роста клеток.

Плотность волокон в питательной среде более 40 г/л вызывает значительную неравномерность распределения клеток по объему волокон и неполное использование их поверхности для роста клеток.

Поверхность стекла в виде волокон диаметром 5-45 мкм располагают в сосуде, подготавливают известными методами подготовки стекла для выращивания клеток (промывают, обезжиривают, стерилизуют).

Наносят на поверхность стеклянных волокон клетки вместе с внесением в емкость питательной среды с клетками. Клетки осаждаются и прикрепляются к поверхности стеклянных волокон. Вес волокон в сосуде и объем внесенной питательной среды с клетками обеспечивает соотношение 2-40 г/л. Стеклянные волокна с прикрепившимися клетками под действием упругих сил свободно, не уплотняясь, располагаются в питательной среде. В сосуде создают благоприятные для роста клеток условия: температуру 37^оС и рН 7,2-7,4. Клетки на поверхности стеклянных волокон начинают расти и размножаться, образуя слои на волокнах и гроздья между волокнами. Питательную среду в сосуде периодически заменяют на свежую. После окончания процесса клетки со стеклянных волокон смывают и собирают известными способами.

П р и м е р 1. Культивировали по предложенному способу клетки перевиваемой линии ПТ (почки теленка) на поверхности стеклянных волокон в сосуде емкостью 5 л в питательной среде объемом 1 л, представляющей собой смесь ФГМС и Игла с 10% сыворотки крупного рогатого скота. Посевная доза клеток составляла 2х10⁵ кл/мл. При выращивании клеток использовали волокна из алюмоборосиликатного стекла диаметром и весом в сосуде соответственно: а) диаметр 5 мкм, вес 2 г (соотношение 2 г/л); б) диаметр 45 мкм, вес 40 г (соотношение 40 г/л); в) диаметр 5 мкм, вес 40 г (соотношение 40 г/л); г) диаметр 45 мкм, вес 2 г (соотношение 2 г/л).

Волокна вносили в сосуд и осаждали на их поверхности клетки из питательной среды.

При культивировании клеток в стационарных условиях при 37^оС заменяли 80-90% питательной среды через каждые 24 ч.

Через 6 сут выращивание клеток прекращали и известными методами определяли качество и количество полученных клеток. Микроскопирование стеклянных волокон показало, что клетки хорошо росли на волокнах и образовали на их поверхностях плотный слой, а между волокнами - гроздья. Урожай клеток составлял 3,1 х 10⁶ - 4,8 х 10⁶ клеток на 1 мл среды в сосуде. Результаты опытов представлены в таблице.

П р и м е р 2. Выращивали по предложенному способу перевиваемую линию клеток почки овцы (ПО-2) на поверхности стеклянных волокон в сосуде емкостью 0,5 л в питательной среде объемом 0,150 л следующего состава: 30% ФГМС, 30% Игла, 30% 199 и 10% сыворотки крупного рогатого скота. В питательную среду вводили клетки ПО-2 в концентрации 1,2 х 10⁵ кл/мл.

При выращивании клеток использовали волокна алюмоборосиликатного, натриево-боросиликатного и кварцевого стекла диаметром 5 - 45 мкм и плотностью 2 - 40 г/л.

Волокна размещали в сосуде и осаждали из питательной среды на их поверхности клетки. Клетки культивировали при 37^оС в течение 5 сут. Через 24 ч проводили полную замену питательной среды.

Рост клеток проверяли микроскопированием. В большинстве клетки вытянутые, на отдельных участках образуют гроздья и мостики между волокнами.

По истечении 5 сут клетки снимали трипсином и оценивали их урожай. Урожай клеток составлял 1,6 х 10⁶ - 2,5 х 10⁶ клеток на 1 мл среды в сосуде. Результаты опытов приведены в таблице.

Для контроля в аналогичных условиях выращивали клетки ПТ и ПО-2 на стеклянных шариках диаметром 3 мм по известному способу (прототип). Урожай клеток на мл среду в сосуде в этом случае составлял соответственно ПТ - около 4,2 х 10⁵, ПО-2 - около (2,7-3,1)х10⁵. Результаты опытов представлены в таблице.

Во всех опытах клетки для оценки их жизнеспособности по тесту образования монослоя переносились в стеклянные плоские колбы или на стеклянные волокна. Клетки, выращенные по предлагаемому способу, не теряли жизнеспособности и росли повторно на плоских колбах и волокнах. За счет применения стеклянных волокон диаметром 5-45 мкм при плотности их в среде 2-40 г/л достигнуто увеличение выхода клеток в 10-15 раз по сравнению с известными способами без снижения качества получаемых клеток и увеличения энергозатрат.

СПОСОБ ВЫРАЩИВАНИЯ КУЛЬТУР КЛЕТОК, включающий подготовку поверхности стекла, нанесение клеток на поверхность стекла, внесение и периодическую замену питательной среды, отличающийся тем, что, с целью повышения производительности способа и удешевления его, в качестве микроносителя используют волокна из стекла диаметром 5 - 45 мкм при плотности волокон в питательной среде 2 - 40 г/л.