Способ получения желатиновых микроносителей для культивирования клеток Советский патент 1987 года по МПК C12N5/00 

t

Изобретение относится области биологии и микробиологической промышленности, в частности к ВЕПращива нию поверхностно-зависимых животных клеток .

Цель изобретения - увеличение выхода и улучшение качества целевого продукта.

Сущность способа заключается в том, что частипы желатинового геля обрабатывают протеолитическими ферментами животного происхождения (О, 25-0,, 75%тный раствор протеолити- ческого фермента при объемных соотношениях раствора фермента к желатиновому гелю (0,75-1,25):, а после этого проводят вторичную обработку ди альде гидами.

Продавливанне желатинового геля через сита определенного размера с последую1дей обработкой частиц проте литическим ферментом обеспечивает плучение микроносителей определенног размера неправильной овальной формы с ровной поверхностью. Данная техно логин обеспечивает получение частиц определенного заданного размера с незначительной дисперсией без этапа их сепарации, что в значительной стпени облегчает процесс получения ми .роносителей. Этот прием позволяет получить микроносители, не применяя этапа суспензионной полимеризации гидрофильных материалов в гидрофобн среде реакции, что в значительной . степени ускоряет получение микроносителей с одновременным улучшением их качеств, например для получения гранулированных микроносителей способом суспензионной полимеризации требуется применение дорогостоящего оборудования (ферментеры), гидрофобной реакицонной смеси(по известному способу З-компонентная смесь), сформировавшиеся частицы необходимо освобождать от компонентов реакционной смеси путем - промывки в органичеких растворителях и растворах детергентов, полученные способом суспензионной полимеризации частицы неизбежно имеют вкраплен: -ш: реакционной среды, что ухудшает качество микронсителей. Предлагаемый способ свободен от перечисленных недостаков.

Пример 1. Приготовление микроносителей.

Смешивают 400 мл 25%-ного водног раствора желатина, полученного при

5

0

5

0

5

0

5

0

5

50°С, со 150 мл 25%-ного водно1 о раствора глиоксаля и интенсивно пе- ремерливают при комнатной температуре мин, Через 10 мин блок желатинового геля продавливают через сито с диаметром отверстий 250 мкм. Полученные частицы (диаметром не более 250 мкм) обрабатывают 0,25%-ным раствором трипсина в О,5 М фосфатном буферном растворе (Б) , рН 7,6,в течение 10 мин в соотношении 550 г частиц геля/0,5 л раствора трипсина при комнатной температуре и постоянном переме1иивании. После этого частицы геля промывают 0,15 М раствором NaCl для удаления трипсина и растворимых продуктов ферментативного расщепления желатинового геля. К отмытым частицам добавляют 100 мл 25%-ного ра- створа глиоксаля и выдерживают 15 мин при комнатной температуре. Затем удаляют раствор глиоксаля фильтрацией на сите с диаметром отверстий 100 мкм частицы суспензируют в 1 л 3%-ного водного раствора перекиси водорода и выдерживают так 30 мин, после чего микроносители пром1з1вают раствором 0,15 М NaCl. Суспендированные в 0,15 М растворе NaCl микроносители стерилизуют автоклавированием при 120 С в .течение 15 мин.

П р и М е р 2, Приготовление микроносителей.

Смешивают 200 мл 35%-ного водного . раствора желатина, полученного при 50 С, с 700 мл 25%-ного водного раст-, вора глутарового альдегида и интенсивно перемешивают при комнатной температуре 1 мин. Через 10 мин блок желатинового геля продавливают через сито с диаметром отверстий 200 мкм. Полученные частицы диаметром не более 200 мкм обрабатьшают 0,5%-ным раствором коллагеназы в 0,15 М ФБ в течение двух минут, при соотношении 270 г частиц геля/230 мл раствора коллгагеназы при 37±1 С и постоянном перемешивании. Затем частицы промывают 0,15 М раствором NaCl. Отмытые частицы обрабатьшают последовательно в 130 мл 25%-ного .раствора глутарового альдегида - 10 мин при комнатной температуре, 0,15 М раствором NaCl для удаления непрореагировавшего сшивающего агента, в 0,5 л 2%-ного раствора боргидрата натрия - 30 мин при комнатной температуре, обильно промьшаизт водой до нейтраль313217

ной рН промьшной жидкости. После этого микроносители ресуспендируют в 0,5 л 0,15 М раствора NaCl,через 10-15 мин промывают свежей порцией изотонического раствора NaCl и сте- с

О

рилизуют автоклавированием при 120 С в. течение 15 мин.

П р и м е р 3, Приготовление микроносителей .

Микроносители получают так же, в примере 2, но используют раствор желатина, в качестве протео- литического агента - 0,75%-ный раствор химотрипсина, в качестве восстановителя - 3%-ньй раствор -5

П р и м е р 4. Желатиновый гель, полученный по примеру 1 (1л), обра- батьгоают 0,75 л 0,25%-ного раствора трипсина в 0,15 М фосфатном буферном растворе, рН 7,6, в течение 10 мин при 25°С и при постоянном перемешивании. Гель далее обрабатывают по примеру 1 и получают I л микроносителя. При выращивании клеток почек зеле- ных мартышек (КПЗМ) по примеру 5 их концентрация через 4-5 сут достигает ,5±0,2 млн/мл, возрастая в 10 раз.

П р и м е р 5. Желатиновый гель, полученный по примеру I (1 л), обра- батьгоают 1,25 л 0,75%-ньм раствором химотрипсина в 0,06 М фосфатном буфе ре, рН 6,4, в течение 12 мин при 20° и при постоянном перемешивании. Гель далее обрабатывают по примеру 1 и получают 1 л микроносителя. При выра щивании клеток КПЗМ по примеру 5 их концентрация через 4-5 сут достигает 1,5±0,2 млн/мл, возрастая в .среднем в 10 раз.

Микроносители, изготовленные сог- ласно описанию, приведенному в приме pax 1-5, имеют практически одинаковые свойства; они представляют собой механически, химически и термически стойкие частицы необходимого диаметра например, 100-250 мкм из по- перечносшитого денатурированного коллагена, обеспечивающего биоспецифическое взаимодействие с клетками. Частицы микроносителей, полученных согласно описанию, приведенному в примерах 1-5, имеют овальную форму, гл-адкую поверхность, отлично подходя- .щую для прикрепления, распластьшания и роста клеток, удельньш вес и коэффициент преломления света, примерно равные таковым у воды,и могут с рав

с

-5

п 25

30

J5

40

45

50

5

84

ньм успехом быть пр1 1енены для яыра- цщвания клеток различных типов.

П р и м е р 6, Выращивание первичных клеток куриных эмбрионов на разработанных микроносителях.

18 мл плотного осадка микроносителей, обеспечиваюп их культуральную площадь около 5000 см, суспендиру- ют в ЬО мл солевого раствора Хенкса. Через 10 мин солевой раствор Хенкса сливают, а микроносители ресуспендируют в 50 мл питательной среды I99 с 5% сыворотки телят, 0,25% падроли- зата лактальбумина, 0,1% галактозы, 20 мМ буфера HEPES и антибиотиками, и суспензито переносят во флакон обье- мом 250 мл с подвешенной мешалкой : (спиннер) . К суспензии микроносителей добавляют 50 мл первичных клеток куриных эмбрионов 9-дневного возраста (клетки суспендируют в среде указанного состава) и во флакон добавляют питательную среду до объема 100 мл. При этом посевная концентрация клеток составляет 0,5 млн/мл, а концентрация микроносителей обеспечивает культуральную площадь около 50 ,

Культивирование проводят при 37 С и плавном перемешивании суспензии микроносителей: в первые сутки культивирования со скоростью 10 об/мин, во вторые и третьи - 20 об/мин, а далее 50-60 об/мин. Начиная со вторых суток культивирования, ежесуточно проводят замену части среды: на вторые и третьи сутки - 50% обьема .. среды, далее 70% объема среды. Спустя 5-6 сут после начала культивирования, на частицах микроносителей формируются сливные культуры первичных клеток куриных эмбрионов. Плотность культур к концу срока культивирования (6 сут) достигает 5,8+0,3 млн. кл/мл, т.е. число первичных клеток куриных эмбрионов возрастает в 11 раз за 6 суток.

Подсчет числа клеток,выросших на микроносителях, проводят по следующей методике. После окончания куль- , тиБирования отбирают пробу 10 мл (предварительно тщательно суспендируют микроносители). После оседания микроносителей в пробе надосадочную жидкость сливают, а культуры на микроносителях несколько раз промывают 0,15 М ФБР. Культуры на микроносителях обрабатывают по методу подсчета ядер клеток.

5 , 13 Пример. Выращивание вторичных клеток почек зеленых мартьппек на разработанных микроносителях.

Вторичные клетки почек зеленых мартьпиек КПЗМ вносят в концентрации кл/мл в суспензию разработанных микроносителей, которые используют в концентрации 5,5 мл плотного осадка на 100 мл среды, что обесне- чивает культуральную площадь около 15 см /мл. Применяют питательную среду следующего состава; максимальная среда Игла (МЭМ) с 10% сыворотки телят, 0,25% гидролизата лактальбуми- на, 0,% галактозы, 20 мМ буфера HEPES и антибиотиками. 330 мл суспензии микроносителей и клеток в питательной среде вносят в спиннер объемом 1 л. Культивирование проводят при 37 С и плавном перемешивании суспензии: 10 об/мин - первые сутки (мешалку включают ка минуту через каждые 40 мин в течение 6 ч после засева клеток, затем мешалка работает постоянно, 20 об/мин - вторые и третьи сутки культивирования и далее 50-60 об/мин. Через 72 ч и через 120 ч после начала культивирования проводят замену соответственно 30 и 70% среды на свежую. Через 6 сут культивирования почти на всех частицах микроносителей наблюдают плотные культуры клеток. К этому времени концентрация клеток достигает 3,8 млн/м

П р и м е р 8 Длительное культивирование клеток на разработанных микроносителях.

Вторичные КПЗМ выращивают так же, как в примере 7. После формирования плотных культур микроносители переносят в роллерные бутыли объемом 0,5 л, внутренние стенки которых предварительно силиконизируют. В каждую бутыль вносят по 175 мл суспензии микроносителей с выросшими культурами. Культивирование продолжают при 37°С при 10 об/мин, в среде такого же состава, как описано в примере 5, но с пониженной до 3% концентрацией сыворотки. Дважды в неделю заменяют 50% среды на свеукую. Еженедельно проводят подсчет клеток по методике, указанной в примере 6, и микроскопирование взятых образцов культур на микроносителях. Наблюдение показывает, что клетки на протяжении 9 недель (срок наблк дения) остаются нрогфачнымИэ сохраняют чет86

кие границы и типичную для них форму, не отслаиваются от 1-1икроносителей. Число клеток на протяжении всего времени наблюдения сохраняется на уровне (3,6±0,36) млн/мл.

П р и м е р 9. Выращивание клеток перевиваемой линии на разработанных микроносителях в среде с обычной и с пониженной концентрацией сыворотки.

На разработанных микроносителях, взятых в концентрации 5,5 мл плотного осадка (100 мл среды 15 , выращивают клетки линии 4647, полученной из почек здоровой взрослой

мартыики. Посевная концентрация клеток линии 46Л7 составляет 15-10 кл/ /мл. Используют питательную среду такого же состава, как в примере 7, но в одном случае среда содержит 10% .

сыворотки, а в другом - 1% сыворотки телят. В обоих случаях в среды добавляли нируват Na до концентрации 1 О мМ и метилцеллюлозу до конечной кони.ентрации 0,3%. Для равнения такие же культуры клеток выращиварот на поверхности стеклянных плоскодонных флаконов объемом 0,1 л. Посевная плотность культур клеток во флаконах такая же, как и в культуре на

микроносителях: 1010 /см. При культивировании клеток в средах с обычной и пониженной концентрацией сьшо- ротки обычными методами (на стеклянной поверхности) и на разработан1гых

микроносителях fколлагеновьш субстрат показано , что при всех прочих равных условиях урожай клеток, выращенных нэ- поверхности стекла при использовании питательной среды с 10%

сыворотки, составляет 80,2%, а при использовании среды с 1% сыворотки достигает 42,2% от урожая клеток, выращенных на разработанных микроносителях .

П р и м е р 0. Выращивание клеток диплоидной линии на разработанных мг-жроносителях.

Диплоидные клетки М-21, полученной из тканей эмбриона человека, выращивают на разработанных микроносителях так же, как в примере 7, с той разницей, что посевная концентрация

клеток в данном случае составляет 310 кл/мл. Через 4 сут культивирования количество ршеток достигает 1,8 млн/мл. Тов. возрастает в 6 раз за 96 ч, при этом большая часть час7

тип, микроносителей покрыта сливным слоем клеток.

, П р и м е р 11. Сбор клеток, вырщенных на разработанных микроносителях.

Первичные клетки эмбрионов выращвают так же, как в примере 6. После окончания культивирования отбирают пробу 10 мл (предварительно тщательно суспендировав микроносители) и п водят подсчет клеток, как в примере 6, Подсчет клеток показьгеает, что их концентрация достигает 5,7 млн/м Остальные микроносители после отмывки от питательной среды ресуспенди- руют в 50 мл 0,15 М и ФБР, содержащего 0,25% трипсина и 0,02 % ЭДТА. Через 5 мин надосадочную жидкость осторожно сливают, микроносители с клетками инкубируют в оставшемся ко личестве диспергирующего раствора в течение 5 мин при комнатной температуре. После этого к суспензии микроносителей добавляют ФБР с 0,5% гид- ролизата лактальбумина и флакон несколько раз энергично встряхивают Отслоившиеся от микроносителей клетки подсчитывают с помощью гемоцито- метра (камера Фукс-Розенталя). Коли чество клеток при этом составляет 5,25 млн/мл.

П р и м е р 12. Желатиновый гель полученный по примеру 1 (1л), обра батьшают 0,6 л 0,20%-ного раствора трипсина в 0,15 М фосфатном буфер- ном растворе, рН 7,6, в течение 10 10 мин при 25 С и постепенном перемешивании. Гель далее обрабатывают по примеру 1. При выращивании клето КПЗМ по примеру 5 на полученном гел концентрация клеток через 4-5 сут достигает 0,17±0,02 млн/мл, возрастая в 1,1 раза, т.е. рост практически не наблюдается. П р и м е р I3. Желатиновый гель полученньш по примеру 1 (1л), об

Составитель В.Муронец Редактор Н.Егорова Техред Л.Олийнык Корректор А.Тяско

Заказ 2723/19 Тираж 499Подписное

БНИШИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

.Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул. Проектная, 4

рабатьшают 1,5л I%-ного раствора трипсина в 0,15 М фосфатном буферном растворе, рН 7,6, в течение 10 мин при 25 С и постоянном перемешивании. Во время обработки желатиновый гель полностью растворяется и получить микроноситель не удается.

Таким образом, улучшение качества предлагаемого микроносителя по сравнению с микроносителем, получаемым по известному способу, достигается более высокой чистотой продукта получаемого по предлагаемому способу: в этом микроносителе отсутствуют среды поликонденсации (масла, углеводородов). Частицы мик- роносителя,пол Т4аемые методом дис- пе рс ионной поликонденсации, соде ржат реакционной среды, которая в дальнейшем оказьгоает токсическое воздействие на клетки. Улучшение качества микроносителя, получаемого по предлагаемому способу, достигается также тем, что предлагаемый способ обеспечивает более высокую однородность фракционного состава микроно-. сителя (98% частиц с размерами 180- 200 мкм). Микроноситель, получаемый по известному способу, -является менее однородны ; (75-80% частиц с размерами 100-250 мкм).

Кроме того, частицы, полученные предлагаемым способом, имеют более однородньга состав, так как -I-DC размер определяется диаметром отверстия - сита, через которое продавливают гель. Во всех известных способах необходима стадия фракционирования частиц по размерам, при которой отход гранул геля составляет 70-80%. Следовательно предлагаемый способ ко- ренным образом изменяет технологию получения микроносителей и позволяет получить высококачественный и более дешевый продукт, причем с более высоким выходом.