Штамм бактерий АZоSрIRILLUм LIроFеRUм для производства удобрения под райграс пастбищный и кострец безостый Советский патент 1993 года по МПК C05F11/08 C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологическим средствам повышения урожая и увеличения содержания азота у небобовых растений.

Цель изобретения - получения штамма бактерий, повышающего азотфиксирующую активность в корневой зоне райграса пастбищного и костреца безостого, урожай зеленой массы и содержание в ней азота.

Это достигается тем, что в качестве такого штамма предлагается штамм Azospirillum lipoferum 4014 В-37, выделенный из отмытых корней райграса пастбищного сорта Аргона, выращенного в условиях вегетационного опыта на дерново- подзолистой почве.

Штамм хранится в музее типовых культур Всесоюзного научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии и имеет регистрационный номер В-37.

Полученный штамм Azospirilluin lipoferum 4014 В-37 характеризуется следующими морфологическими и физиолого-би- охимическими признаками.

На полужидкой малатной среде Доберейнер бактерия в молодом возрасте (1-2 сут) имеет вид крупных (1,0-1,5x4,0-5,0 мкм) слегка изогнутых активно подвижных палочек. При движении форма клеток S-обрзз- ная. При старении культура утрачивает подвижность и характеризуется морфологическим разнообразием. Содержит включения поли-/ -оксимасляной кислоты. В возрасте 4-7 суток наблюдается агрегация клеток с последующими фрагментированием протоплазмы с образованием покоящихся форм, напоминающих цисты.

На полужидкой малатной среде Добе- рейнер образует типичную пленку серовато-белого цвета, находящуюся от ее поверхности на расстоянии около 1-2 мм.

На агэризованной среде Доберейнер с дрожжевым экстрактом колонии мелкие (1- 2 мм в диаметре), сухие, складчатые или морщинистые, как правило целиком снимаются петлей. На картофельном агаре колонии значительно крупнее (в диаметре до 5 мм и более), пастовидные с перламутровым оттенком.

Штамм 4014 растет в интервале темпе- ратур 6-40°С, оптимальной для культивирования является температура 35°С. Оптимальное значение рН - 6,8-7,0.

Штамм нуждается в биотине. Способен использовать глюкозу в качестве единственного источника углеродйого питания и энергии (что является видовым признаком). Растет и фиксирует азот в безазотных полужидких средах с глюкозой, галактозой, яблочной, янтарной,.молочной и фумаровой кислотами. На полужидкой малатной среде Доберейнер штамм фиксирует 27,33 мкг азота на 3 мл среды за 24 .часа (9,11 мкг азота на 1 мл среды). В ассоциации с растениями активность азотфиксации значительно превышает активность контрольного варианта. Например: в ассоциации с корня- ми райграса азотфиксирующая активность штамма составляет 63 мкг N/r корней/сутки; в контроле (без инокуляции) - 31,6 мкг N/r корней/сутки. В ассоциации с корнями костреца безостого активность азотфиксации достигает 107,2 мкг азота на 1 г корней/сутки. В контроле (на корнях небактеризованных растений) -- активность азотфиксации равнялась 53,8 мкг азота/1 г корней за сутки.

Штамм не использует в качестве единственного источника углерода сахарозу, мальтозу, рамнозу, раффинозу, сорбит, дульцит, крахмал. Микроэзрофил при выращивании в безазотной среде, аэроб при вы- ращивании на средах, снабженных связанным азотом.

На агаризованной среде Доберейнер штамм образует розовый пигмент. Пигмент не растворим в йоде и не диффундирует в среду.

Клетки грамотрицательные, подвижные, монотрихи на полужидкой среде Доберейнер. Использует аммонийную форму

азота, нитраты. Растет на МПА и МПБ. Имеет положительный тест Хью-Лейфсона: в анаэробных условиях слабое кислотообра- зование, газообразные продукты не образует, Каталазо- и оксидазо - положителен, Экзополисахариды не синтезирует. Спор не образует. .

Маркерные признаки не обнаружены.

Штамм A.lipoferum 4014 ВНИИСХМ В- 37 растет на средах следующего состава:

Среда Доберейнер (г/л):

яблочная кислота - 3,6

КН2РСм-0,4

К2НРСм-0,1

МдзСч -7Н20-0.2

NaCI-0,1

CaCl2 6Н20-0,02

,01 . Na2Mo04 - 0,002

Дрожжевой экстракт - 1,00

Бромтимоловый синий(0,5% спиртовой раствор) - 5,0 (мл)

Агар-3,0.

рН - 6.8-7,0

Картофельная среда, (г/л):

Картофель - 200

Яблочная кислота - 2,5

КОН-2,0

Сахароза - 2,5

Агар-20,0

рН-6,5

Штамм 4014 В-37 хранят и периодически пересевают (1 раз в 2 месяца) на картофельном агаре и среде Доберейнер. Температура хранения - 4-б°С (в холодильнике). При хранении штамма под слоем минерального масла в течение 12 месяцев изменение свойств штамма не наблюдали.

Штамм Azospirillum lipoferum 4014 В-37 идентифицирован по определителю Берги,

Изучение активности азотфиксации штамма Azospirillum lipoferum 4014 в сравнении с прототипом проводили в условиях лабораторных и вегетационных опытов.

Пример 1. Среду Доберейнер (по 3 мл в каждом сосуде) инокулировали клетками штаммов A.lipoferum 4014 и С-1/25. По- с ле 72 часов инкубации в термостате определяли активность азотфиксации ацетиленовым методом на хроматографе Chrom-4. Повторность опыта трехкратная.

Результаты определения представлены в табл.1,

Активность азотфиксации чистой культуры штамма 4014 достоверно выше активности прототипа.

Пример 2. Семена райграса пастбищного сорта Аргона и костреца безостого

сорта Козаровичский замачивали отдельно в бактериальных суспензиях штаммов A.lipoferum 4014 и A.lipoferum C-1/25 в течение 1.6 часов. Плотность бактериальных суспензий составила около 11-10 клеток в 5 1 мл. После замачивания семена высевали в сосуды с 0,5 кг дерново-подзолистой почвы. В опыте был предусмотрен контроль - высев семян не инокулированных азоспирил- лами. Сосуды со всходами райграса и 10 костреца помещали в люминостат с освещением 20000 люкс в течение 16 часов ежедневно. Температуру в люминостате поддерживали на уровне 2б°С ±1°. Повторность опыта - пятикратная. В каждом сосу- 15 де оставляли по 3 растения. Через 1 месяц выращивания растений в сосудах определяли азотфиксацию ацетиленовым методом. Результаты определений активности азот- фиксации в ассоциации с растениями райг- 20 раса и костреца приведены в таблице 1. Как следует из таблицы, под райграсом и кострецом в ассоциации с азоспириллами активность была существенно выше чем в контроле. При этом, штамм A.iipoferum 4014 25 обеспечивал достоверное превышение в азотфиксации по сравнению с прототипом.

Эффективность бактеризации райграса и костреца испытывали в вегетационных и полевых опытах на дерново-подзолистой 30 почве опытного хозяйства. УНИИСХ микробиологии. Сорт райграса - Аргона, сорт костреца - Казаровичский,

Для получения бактериальной суспензии штаммов готовили питательную среду 35 Доберейнер (без агара), состав которой приведен выше, в колбы засевали штамм бакте- рий и выращивали на качалке.при 180-200 об/мин и 28°С в течение 3 суток. Влияние предпосевной обработки семян райграса на 40 урожай, содержание азота в нем и активность азотфиксации в корневой зоне растений испытывали также в производственном опыте в колхозе Червоний прапор Черниговской области (почва-дерново-лодзоли- 45 стая, сорт райграса - Вея).

Пример 3. Семена райграса замачивали отдельно в бактериальных суспензиях штаммов A.lipoferum 4014 и A.lipoferum С- 50 1 /25 в течение 16 часов. Плотность бактериальной суспензии составила 11 10 клеток в 1 мл. Для бактеризации использовали культуры 3-суточного возраста. После замачивания семена высевали в сосуды с 1,5 кг 55 почвы. В каждом сосуде составляли по пять растений. В опыте был предусмотрен контроль - обработка семян стерильной водой. Повторность опыта - четырехкратная.

Результаты испытания эффективности инокуляции райграса штаммами азоспи- рилл в вегетационном опыте представлены в табл.2.

Из табл.2 видно, что инокуляция семян штаммом Azospirillum lipoferum 4014 достоверно повысила урожай зеленой массы растений как по сравнению с контролем, так и с прототипом. Бактеризация способствовала также увеличению содержания азота в урожае на 12,3%.

Пример 4. В условиях вегетационного опыта испытали эффективность бактеризации костреца безостого предлагаемым штаммом и прототипом. Условия постановки и проведения опыта аналогичны вышеприведенному примеру. Результаты опыта приведены в табл.3.

Как следует из табл.3, бактеризация штаммом 4014 достоверно повышает урожайность костреца безостого, а также содержание азота в надземной массе. Инокуляция семян костреца штаммом С- 1/25 - прототипом, - не способствует увеличению показателей.

Пример 5. Полевой опыт. Семена райграса пастбищного перед посевом отдельно обрабатывали суспензиями клеток четырехсуточных культур A.lipoferum штамма С-1/25 и штамма 4014..Плотность суспензий около 11,0 -10 клеток в 1 мл. Семена контрольного варианта обрабатывали водой. Во все делянки опыта вносили минеральные удобрения в дозе: ЫадРеоКбО. Повторность опыта - четырехкратная. Площадь каждой делянки 21 м .

Данные по эффективности бактеризации райграса в полевом опыте представлены в табл.4.

Как свидетельствуют полученные результаты, предпосевная инокуляция семян райграса штаммом A.lipoferum 4014 значительно и достоверно увеличивает урожайность зеленой массы райграса и содержание азота в урожае. Кроме того, в корневой зоне райграса, инокулироеанного штаммом 4014, значительно возрастает активность азотфиксации. В опыте подтверждается эффективность штамма-прототипа, однако она уступает эффективности заявляемого штамма.

Пример 6. Полевой опыт. Семена костреца безостого инокулировали аналогично описанному в предыдущем примере.

Данные по эффективности бактеризации костреца безостого приведены в табл.5,

Как следует из табл.5, инокуляция штаммом-прототипом костреца безостого не приводит к достоверному увеличению урожал травы. Бактеризация штаммом №4014 остоверно увеличивает урожай костреца и содержание азота в нем.. -V

Активность азотфиксации также наибольшая в варианте со штаммом A.lipoferum 4014....

Пример 6. Производственный опыт. Семена райграса пастбищного обрабатывали экспериментальными партиями торфяного препарата на основе штаммов A.lipoferum С-1/25 и 4014 В-37. Препарат на основе предлагаемого штамма готовится следующим образом.

1-я стадия - получение посевного материала.

Маточной культурой, выращенной в колбах, засевают колбы или другие, сосуды из расчета 4-5% к обьему .питательной среды следующего состава (об. %).

Меласса-2% . Кукурузный экстракт - 2%

Вода - остальное

рН - 7,0-7,2

Выращивание посевного материала проводят на круговой качалке с 180-200 об/мин при 30-32°С в течение 24-х. часов. Посевной материал используется для засева питательной среды вышеприведенного состава в бутылях или ферментерах при глубинном выращивании культуры.

2-я стадия - получение инокулюма.

Посевную культуру вносят в среду в бу- тылях или ферментерах в количестве 4-6% от ее объема. Культивирование проводят при 30-32°С на постоянно работающей качалке. Выращивание ведут в течение 48 часов.

3-я стадия - инокуляция торфа и термо- статирование. Перед инокуляцией в стерильный торф вносят стерильный 50%-й раствор декстрина из расчета 8% от предполагаемого объема инокулюма. В пакеты с торфом и декстрином вносят инокулюм

(50 мл на 140 г торфа). Конечная влажность препарата составляет 45-55%. Пакеты с инокулированным торфом выдерживают при температуре 35°С в течение 15 дней для

увеличения титра бактериальных клеток. Срок годности препарата - до 6 месяцев. В 1 г препарата,содержится 3-5 млрд. клеток бактерий. На одну гектарную норму семян необходимо 200 г препарата. Обработанные

препаратом семена высевали зернотуковой сеялкой поделяночно. Площадь каждой делянки равнялась 2200 м2. Учитывали урожай зеленой массы.

Результаты производственного опыта

(среднее за 2 года) приведены в табл.6.

Как свидетельствуют полученные данные, инокуляция была зффективной по всем трем-агрофонам, причем штамм 4014 В-37 во всех случаях обеспечивал более существенную прибавку, чем штамм-прототип. Об-, ращает внимание то обстоятельство, что при инокуляции штаммом 4014 В-37 получена прибавка больше, чем при внесении 80 кг минерального азота на гектар. Эти данные

говбрят о том, что применение предлагаемого штамма для производства бактериального удобрения позволит значительно сократить дозы вносимых азотных удобрений.

Таким образом, предпосевная обработка семян райграса пастбищного и костреца безостого активным ассоциативным азот- фиксатором Azospirillum lipoferum № 4014 ВНИИСХМ В-37 увеличивает активность

азотфиксации в корневой зоне, повышает урожай зеленой массы трав, что позволяет сократить применение азотных минеральных удобрений подданные культуры. Формула изобретен и я

Штамм бактерий Azospirillum lipoferum ВНИИСХМ В-37 для производства удобре-. ния под райграс пастбищный и кострец безостый.

Таблица.

Таблица 2

Использование: производство микробиологических средств повышения урожая и увеличения содержания азота у небобовых растений. Сущность изобретения: штамм бактерий Azospirillum lipoferum выделен из корней райграса. Депонирован в коллекции ВНИИСХМ под Ns B-37. Штамм выращивают на среде Доберейнер в течение 72 ч. Активность азотфиксации в чистой культуре 9.11 ±0,41 мкг/мл среды/24 ч, а у известного 7,0±1,11, активность азотфиксации в ассоциации с растениями райграса 63 мкг/г корней/24 ч, костреца- 107,2 мкг/г корней/24 ч, а у известного соответственно 47,4 и 82,2 мкг/мл среды/24 ч. 6 табл. ттусе H3sm

HCPos

0,21

HCPos

0.33

НСР05

27,5

Таблица 3

Таблица 4

HCPos37,3

- среднее за вегетационный период

Таблица 5

Та б л и ц а 6