Способ получения экстрагента холестерина Советский патент 1985 года по МПК A61K31/575 C07J9/00 

Изобретение относится к медицинской химии, а именно к способам получения экстрагентов, обладающих способностью извлекать холестерин из мембран липопротеидов крови, форменных элементов крови (эритроцитов, тромбоцитов) и клеток стенки кровеносных сосудов.

Известен способ получения липосом из фосфатидилхолина яичных желтков в качестве экстрагента холестерина из мембран микросом печени. Согласно способу экстра.гент получают облучением яичного фосфатидилхолина ультразвуком с последующим центрифугированием для удаления недиспергированного фосфатидилхолина 1.

Известен также способ получения экстрагента холестерина из мембран фибробластов кожи в виде липосом из яичного фосфатидилхолина 2.

Недостатком липосом из фосфатидилхолина яичных желтков как экстрагента холестерина является их небольщая емкость по холестерину и низкая стабильность, в результате чего при хранении липосомы необратимо аггрегируют и выпадают в осадок.

Известен способ получения экстрагента холестерина путем смешивания фосфатидилхолина и детергента в вид& смешанных мицелл фосфатидилхолина яичных желтков и натриевой соли таурохолевой кислоты, заключающийся в растворении фосфатидилхолина яичных желтков и таурохолата натрия в метаноле при соотношении фосфатидилхолин: таурохолат 1:2, упаривании метанола, добавлении забуференного водного раствора и интенсивном перемешивании до просветления 3.

Недостатком известного способа является низкая емкость получаемого экстрагента по холестерину, а также выраженное токсическое действие солей холевых кислот, являющихся жесткими анионными детергентами, на биологические мембраны.

Цель изобретения - повышение емкости экстрагента по холестерину.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения экстрагента холестерина путем смешивания фосфатидилхолина и детергента суспензию, содержащую 1 мае. ч. фосфатидилхолина из соевых бобов, 0,1-0,4 мае. ч. смеси полипропиленгликоля и полиэтиленгликоля с мол. массой 2000- 9000 в массовом отношении 1-9:1-4 и 0,002-0,04 мае. ч. цетилтриметиламмонийбромида при содержании фосфатидилхолина 10-25 мг/мл облучают ультразвуком при 1-4°С в течение 1 -10 мин.

Пример. В круглодонную колбу объемом 500 мл помещают 5 г фосфатидилхолина соевых бобов, добавляют 50 мл диэтилового эфира, закрывают колбу пробкой и перемешивают содержимое до полного растворения фосфатидилхолина. Диэтиловый эфир упаривают на роторном испарителе при 40°С.

Приливают к содержащемуся на стенках колбы фосфатидилхолину 200 мл водного раствора, содержащего 1 г смеси полипропиленгликоля (ППГ) и полиэтиленгликоля (ПЭГ) (массовое соотношение 9:1) с мол. м. 2000 и 0,05 г цетилтриметиламмонийбромида. Смесь ППГ и ПЭГ в соотношении 9:1 (мол. м. 2000) выпускается фирмой «Серва (ФРГ) как неионный детергент «Плюроник L-61. Кроме детергента «Плюроник L-бЬ

при производстве экстрагента могут быть использованы аналогичные ППГ и ПЭГ - «Плюроник L-61 (соотношение ППГ:ПЭГ 3:2, мол. м. 3000) и «Плюроник F-68 (соотношение ППГ:ПЭГ 1:4, мол. м. 9000). При использовании указанных детергентов класса «Плюроник могут быть получены экстрагенты, извлекающие большие количества холестерина и имеющие меньшую токсичность, чем известные.

Таким образом, смеси ППГ и ПЭГ могут

0 иметь мол. м. 2000-9000, а соотношение ППГ и ПЭГ возможно 1:9-1:4. Иные детергенты на основе ППГ и ПЭГ с О1личным соотношением ППГ и ПЭГ не выпускаются промышленностью.

с Интенсивно перемешивают содержимое вплоть до полного отделения фосфатидилхолина от стенок колбы и его солюбилизации. Образующуюся мутную жидкость молочного цвета переносят порциями по 20 мл в стеклянные стаканы на 50 мл, которые

0 помещают в водяной бане со льдом, и воздействуют ультразвуком на ультразвуковом дезинтеграторе дробно по 30 с с перерывами в 1 мин до получения прозрачной опалесцирующей жидкости. Общее время воздействия ультразвука 5 мин. Полученную

жидкость центрифугируют при 20.000Xg в течение 15 мин с целью удаления кусочков металла, попадающего с наконечника ультразвукового дезинтегратора. Полученный экстрагент ампулируют под током азота и хранят в ампулах объемом 10 мл при О-4°С.

Полученный экстрагент имеет положительный заряд и содержит 25 мг фосфатидилхолина в 1 мл. Массовое соотношение фосфатидилхолина смеси полимеров и цетилтриметиламмонийбролида1:0,2:0,01.

5 Экстрагент имеет положительный заряд и извлекает 30% холестерина in vitro из мембран эритроцитов в следующих стандартных условиях. Соотнощение тени эритроцитов: экстрагент по фосфолипиду 1:2, время инкубации 3 ч, температура 37°С, состав инкубационной среды 100 мМ г/9«с-НС1 буфер, рН 7,4, 0,5 мл этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА); 3 мг фосфолипида теней эритроцитов ; 6 мг фосфолипида экстрагента; объем инкубационной смеси 3.5 мл. При исследовании острой токсичности экстраген5 та на белых мыщах - самцах весом 16- 18 г при внутрибрюшном способе введения экстрагента LDso составляет 90 мкл/г веса животного.

В табл. 1 приводятся сравнительные данные по извлечению холестерина из мембран эритроцитов кроликов экстрагентами на основе фосфатидилхолина, получаемыми согласно предлагаемому способу, прототипу и аналогу.

В табл. 2 приводится отношение ХС/ФЛ в мембранах эритроцитов и тромбоцитов, индекс атерогентности и площадь стенки аорт, занимаемая отложениями липидов в опытной и контрольной группах животных.

Экстрагент вводят кроликам-самцам породы Шиншилла весом 2,5-4 кг с экспериментальным атеросклерозом. Контрольная группа животных находится в режиме спонтанной регрессии экспериментального атеросклероза. Экстрагент вводят животным внутривенно медленно в течение месяца по 3-4 инъекции в неделю в общей дозе на одного животного, равной 200 мл экстрагента. Об извлечении холестерина из биологических мембран при введении экстрагента судят по уменьшению отношения холестеПоложительно заряженные мицеллы соевого фосфатидилхолина(предлагаемый способ)

Извлечение

рин/фосфолириды (ХС/ФЛ) в мембранах эритроцитов и тромбоцитов, индекса атерогенности.

Общий ХС-ЛВП-ХС

ЛВП-ХС

и площади стенки аорт, занимаемой отложениями липидов у животных, получавщих Экстрагент по отношению к животным контрольной группы.

Результаты свидетельствуют, что получаемый по предлагаемому способу экстрагент способен извлекать холестерин из мембран эритроцитов, тромбоцитов, липопротеидов крови и клеток стенки кровеносных сосудов при внутривенном введении животным с экспериментальным атеросклерозом.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получать экстрагент на основе фосфатидилхолина, обладающий повышенной емкостью по холестерину и способный извлекать холестерин как in vitro, так и in vivo.

Таблица 1

Липосомы из яичного фосфатидилхолина (аналог)

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКСТРАГЕНТА ХОЛЕСТЕРИПА путем смешивания фосфатидилхолина и детергента, отличающийся тем, что, с целью повышения емкости по холестерину, суспензию, содержащую 1 мае. ч. фосфатидилхолина из соевых бобов, 0,1-0,4 мае. ч. смеси полипропиленгликоля и полиэтиленгликоля с мол. массой 2000-9000 в массовом соотношении 1-9: и 0,002-0,04 мае. ч. иетилтриметиламмонийбромида, при содержании фосфатидилхолина 10-35 мг/мл облучают ультразвуком при О-4°С в течение 1 - 10 мин. (Л 00 со

Примечание: Р. достоверность различий между предлагаемым способом и аналогом, между прототипом и аналогом. Р. - достоверность различия между предлагаемым способом и прототипом. Таблица 2