Штамм Е. @ @ 1651,содержащий плазмиду @ @ 307-продуцент термолабильного токсина Советский патент 1987 года по МПК C12N15/00 

Изобретение относится к ветеринарии и медицине, а именно к получению непатогенного штамма E.coli, характе ризующегося повышенной продукцией термолабштьного токсина. . Препарат термолабильного токсина E.coli является веществом, необходим мым для получения вакцин и сывороток против диарейных .заболеваний человека и животных, вызьшаемых патогенным E.coli. Известные штаммы E.coli, продуцирующие термолабильный токсин, являлись природными патогенными штаммами, вьщелёиными от .больных .животных и людей. Эти штаммы характеризуются относительно низкой продукцией токсина (0,4-0,5 мг на 1 л культуральной жидкости). Цель изобретения - создание генно инженерным способом высокопродуктивного штамма термолабильного знтеротоксина, непатогенного для животных и человека. Предлагаемый штамм E.coli KS 1651 синтезирует в 10 раз больше термолабильного токсина, чем исходный природный штамм Н74-I14, вьщеленный от больного человека..Штамм KS 1651 является непатогенным, так как создан на основе штамма E.coli К12, который не может колонизировать тонкий кишечник животных и человека место действия термолабильного знтеротоксина. ШтаМм KS 1651 содержит гибридную плазмиду pLT307,созданную на основе векторной плазмиды pBR322 и природной плазмиды,вьщелениой из штамма Н74-114 и детерминируняцей синтез, термолабильного токсина. Конструирование плазмиды pLT307 осуществляли с помощью рестриктационной эндонуклеазы Р st 1. Полученная гибридная плазмнда содержит ; вставку размером в 6 тыс.нуклеотвд- ных пар. Количество копий плазмиды р Т308 на одну клетку штамма KS1651 составляет около 20. Штамм E.coli KS1651 хранится в коллекции Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиоло гии им.Н.Ф.Гамалеи АМН СССР под регистрационным номером 10. Характеристика штамма. Морфологические признаки. Клетки прямые палочковидной формы, i,I-1,5х X 2,0-6,0 мк, подвижные с перитрихиальными жгутиками, грамотрицательные, неспорообразующие, не кислотоустойчивые , оксидазоотрицательные. Культуральные признаки. Хемрорганотрофы. Метаболизм дыхательный и бродильньй, каталазо-положительные. Среда Эндо. Колонии бледно-розового цвета, блестящие с ровными краями, через 24 ч достигают 1,01,2 мм в диаметре. Мясо-пептонный агар. Колонии беловатого оттенка, вязкой консистенции, гладкие, круглые, прижатые с ровными краями. Кровяной агар. Колонии бледно-серого цвета, круглые с ровными краями. Гемолиз не выявлен. Среда Эванса. Азробные условия выращивания. Через 5 ч образуют муть. Через 15 ч на дне пробирки появляется микробная взвесь сероватого цвета. Мясо-пептонный бульон. Аэробные условия выращивания. Через 6 ч образуют ровную интенсивную муть. Через 24 ч на дне пробирки появляется микробная взвесь серовато-белого цвета. I. Физиолого-биохимические признаки. Бактерии штамма E.coli KS1651 растут в пределах от 5 до 43°С при оптимуме 37С и рН 6,8. В качестве источника углерода используют многие углеводы, спирты, органические кислоты. Глюкоза, мальтоза, арабиноза, рамноза и другие углеводы сбраживаются с образованием пирувата. Бактерии в качестве источника азота используют как минимальные соли в аммонийной и нитратной форме, так и в органической форме в виде пептона, аминокислот. Желатину не разжижают. Уреазной активностью не обладают. Индолане.образуют. Устойчивы к тетрациклину (20 мкг/мл). Непатогеиные для лабораторных животных. Для количественного определения термолабильного энтеротоксина использовали метод двойной диффузии в агарозном геле. Для этой цели были использованы препараты антитоксической противохолерной сьшоротки. Как известно, аминокислотные последовательности соответствующих субъединиц термолабнльного токсина E.coli и Vibrio cholera во многом гомологичны, а сами субъединицы им31

мунологически родственны. Поэтому для термолабильного токсина E.coli применяются антихолерная сьшоротка.

Использование штамма KS1651 для получения термолабильного токсина иллюстрируется следующим примером

П р им ер. Бактериальные клетки объемом 50 мл выращивают в течение ночи в 0,5 л колбах в среде Эванса, содержащей 2%-ные казаминовые кислоты, 0,6%-ный дрожжевой экстракт, 0,25%-ный NaCl, 0,87%-ный и 0,25%-ный раствор глюкозы. Клетки осаждают центрифугированием и ресуспендируют в 0,01 М трис НС1 рН 8,6. Клеточную суспензию подвергают озвучиванию в ультразвуковом дезинтеграторе.

При двухкратном титровании клеточных лизатов щтамма KS1651 положительная реакция в гель диффузии с антитоксической противохолерной сывороткой наблюдается в разведении 1:128. В то же время, лизаты клеток

22704

штамма Н74-114, полученные в тех же условиях, в гель-диффузии проявляют активность в разведении 1:16. Учитывая тот факт, что чувствительность 5 этой реакции для энтеротоксина составляет 2 мкг/мл, можно считать, что концентрация термолабильного энтеротоксина в клеточных лизатах штаммов KS 1651 и H74-I14 составляет не ме0 нее 10 и 1 мг/л культуры соответст- . . венно.

Непатогенность и вьюокая продуктивность полученного штамма делают

5 егоперспективным для налаживания производства энтеротоксина E.coli в промьшшенном масштабе.Энтеротоксин может быть использован для получения химических вакцин, антисыворо0 ток и других диагностических препаратов против диарейных заболеваний животных и человека, вызываемых патогенными штаммами E.coli и WLbrio cholera.

ГОтамм E.coli KS1651, содержащий плазмиду pLT307, № 10 коллекция Наз но-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им.И.Ф.Гамалеи - продуцент термолабильного токсина.