ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI КМ 148 - ПРОДУЦЕНТ ПРОТЕКТИВНЫХ АНТИГЕНОВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИММУНОПРОФИЛАКТИКИ КОЛИБАКТЕРИОЗА И ХОЛЕРЫ Российский патент 2004 года по МПК C12N1/21 A61K39/108 A61K39/106 C12N1/21 C12R1/19 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к конструированию штамма кишечной палочки, эффективно продуцирующего основные протективные антигены: В-субъединицу холерного токсина и адгезии (или фактор колонизации кишечника) CFAI, и может быть использовано для иммунопрофилактики колибактериоза и холеры, а также для создания новых диагностических тест-систем, позволяющих выявлять протективные антигены в других штаммах и в холерных профилактических препаратах.

Известен штамм E.coli KS3043 - продуцент В-субъединицы холерного токсина, уровень продукции составляет 0,85 мкг/мл (Н.В.Янишевский, А.Л.Гинцбург, Ю.В.Вертиев, Ю.М.Демме, Г.И.Каратаев, Г.Б.Смирнов. Конструирование рекомбинантных плазмид, кодирующих биосинтез В-субъединицы холерного токсина //Молекул.генетика.-1987,-№4). В-субъединица холерного токсина у этого штамма находится в периплазме и не секретируется во внешнюю среду. Для ее выделения необходимо разрушение клеток с помощью воздействия как физических, так и химических факторов. Штамм не обладает колонизирующей способностью кишечника.

Известен авирулентный штамм бактерий V.cholerae eltor Inaba KM 184 (патент РФ №2058388, МКИ C 12 N 1/20, А 61 К 39/106//(C 12 N 1/20, C 12 R 1/63)), предложенный для иммунопрофилактики холеры. Штамм содержит в хромосоме ген В-субъединицы холерного токсина (В-ХТ) и плазмиду антигенов колонизирующего фактора CFA1.

Однако присутствие в этом штамме токсинкорегулируемых пилей адгезии (TCP), служащих рецепторами для умеренного бактериофага (СТХϕ), несущего гены холерного токсина, создает теоретическую возможность реверсии этого штамма в токсигенный. Согласно результатам доклинических испытаний V.cholerae eltor KM 184 этот штамм не может считаться биологически безопасным (Т.И.Анисимова, И.Г.Дроздов, Т.Н.Щуковская и др. Государственные доклинические испытания V.cholerae eltor KM 184, предлагаемого в качестве вакцинного // Пробл. комиссия “Холера и патогенные для человека вибрионы”. Ростов-на-Дону, 2002. Вып.15. С. 108-109).

Отсутствие к настоящему времени поливалентных профилактических препаратов против диарейных заболеваний, вызываемых токсигенными штаммами V.cholerae и E.coli, обусловило конструирование авирулентного штамма кишечной палочки с высокой продукцией В-субъединицы холерного токсина и фактора колонизации (или адгезина) CFAI, специфичного для патогенных штаммов E.coli.

Для создания более эффективных живых вакцин, предназначенных для иммунопрофилактики против колибактериоза и холеры, необходимы штаммы E.coli с гомо- и гетерологичными генами протективных антигенов, которые обуславливают соответственно формирование антитоксического и антиколонизирующего иммунитета.

Задача изобретения конструирование стабильного непатогенного для человека и животных штамма с высокой продукцией основных протективных антигенов.

Сущность изобретения заключается в том, что получен авирулентный штамм - продуцент протективных антигенов: В-субъединицы холерного токсина и фактора колонизации CFAI, являющихся основными иммуногенами.

Заявляемый штамм создан на основе изученного авирулентного штамма Е.cоli М17 ( являющимся основой профилактического препарата колибактерина) путем коньюгативного введения в клетки этого штамма рекомбинантных плазмид: плазмиды рIЕМ3 (Кm^rТс^r) с клонированными генами холерного токсина (ctxB) и плазмиды pCFAl(Tp^r) с генами, ответственными за колонизацию кишечника (cfal).

Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ “Микроб” (г. Саратов) под номером КМ 148.

Характеристика штамма Escherichia coli KM148.

Морфологические признаки.

Клетки прямые, палочковидной формы, подвижные, с перитрихиальными жгутиками, грамотрицательные, неспорообразующие.

Патогенные свойства.

Штамм является непатогенным для человека и животных.

Культуральные свойства.

Хемоорганотрофы, каталазоположительные. Растут на питательных средах при оптимальной температуре 37°С при рН 7,2, образуя ровную интенсивную муть. Прототроф.

Плазмидный состав.

Штамм КМ 148 содержит две гибридные плазмиды:

- плазмиду рIЕМ3, несущую структурный ген ctxB, детерминирующий биосинтез В-субъединицы холерного токсина, а также гены устойчивости к тетрациклину и канамицину;

- плазмиду pCFAI, несущую гены фактора колонизации кишечника человека CFAI и гены устойчивости к триметоприму.

Основные свойства штамма:

- Высокий уровень продукции В-субъединицы холерного токсина в среду выращивания - 10 мкг/мл.

- Наличие адгезина CFAI - основного колонизирующего фактора.

- Способность к выработке антитоксических и антиадгезивных антител.

Пример 1. Определение стабильности наследования рекомбинантных плазмид в клетках штамма.

Стабильность плазмид рIЕМ3 и pCFAI определяли путем выращивания в неселективных условиях в течение 72-96 часов на LB бульоне при 37°С, затем рассевали до моноколоний на LB агаре. Полученные трансконъюгаты проверяли по маркерам резистентности двух плазмид, т.е. определяли устойчивость к канамицину (50 мкг/мл) и тетрациклину (10 мкг/мл), кодируемую плазмидой р1ЕМЗ, а также резистентность к триметоприму (150 мкг/мл), определяемую плазмидой pCFAI. Оказалось, что все изученные трансконъюгаты (проверено более 3000 независимо отобранных колоний) в течение 144-192 генераций сохраняли плазмиду pCFAI, кодирующую продукцию фактора колонизации. Из этого следует, что стабильность наследования этой рекомбинантной плазмиды с клонированным геном cfal клетками штамма Е. coli KM148 высокая и составляет 100%. Что касается плазмиды рIЕМ3, несущей ген ctxB, то были отобраны диплазмидные клоны со 100%-ной стабильностью наследования плазмиды рIЕМ3 для последующих исследований.

Стабильность введенных рекомбинантных плазмид проверялась также в условиях in vivo при пассажах рекомбинантного штамма в организме лабораторных животных - белых мышах и крольчат-сосунков. Установлено, что при пассировании штамма E.coli КМ148 в течение 48 часов в организме белых мышей (внутрибрюшинное заражение в дозе Ix10⁷ м.т.) и последующем высеве его на неселективный агар все выросшие клоны содержали в их клетках обе плазмиды - рIЕМ3 (KmrTc^r) и pCFAI (Tp^r).

Крольчата-сосунки заражались указанным штаммом внутрижелудочно (1×10⁹ м.т.). Через 48 часов после заражения высеянные на полноценный агар моноколонии проверялись на наличие плазмидных маркеров резистентности к антибиотикам. Установлено, что после 48-часового пребывания в кишечнике крольчат 100% изученных клонов сохраняли оба репликона - рIЕМ3 и pCFAI.

Пример 2. Определение продукции протективных антигенов.

Для оценки экспрессии гена В-субъединицы холерного токсина в сконструированном штамме E.coli KM148 была использована реакция пассивного иммунного гемолиза (РПИГ) на плотной среде и иммуноферментный метод (ELISA). По данным РПИГ введенный ген cixB эффективно экспрессировался штаммом E.coli KM148 (зона гемолиза эритроцитов у изучаемого штамма заметно превышала размер зоны гемолиза у высокотоксигенного штамма V.cholerae 569B).

Продукцию холерного токсина определяли также высокочувствительным количественным иммуноферментным методом EL1SA. Установлено, что по результатам этого метода сконструированный штамм продуцирует в среду выращивания 10,0 мкг/мл В-субъединицы холерного токсина, что почти в 12 раз превышает продукцию в ранее созданном штамме-продуценте этого антигена E.coli KS3043 (0,85 мкг/мл).

Кроме того, если в клетках рекомбинантных штаммов E.coli, содержащих клонированный ген В-субъединицы холерного токсина, более 98% продуцируемой В-субъединицы остается в периплазме, а не секретируется наружу, то в созданном нами штамме E.coli KM148 продуцируемый антиген секретируется наружу.

Для оценки экспрессии гена фактора колонизации cfal была использована маннозорезистентная гемагглютинация (МРГА) клетками E.coli KM148 человеческих эритроцитов (группа крови I), поскольку адгезии CFAI способен агглютинировать указанные эритроциты. Так как адгезивные свойства штаммов коррелируют с их гемагглютинирующей активностью, то по данным МРГА мы могли судить о продукции адгезина CFAI.

Адгезию клеток сконструированного штамма определяли на среде CFA - оптимальной для биосинтеза клетками адгезина CFAI. Клетки штамма КМ148 агглютинировали человеческие эритроциты 1-ой группы крови в титре 22,0×10⁶, что в 12 раз превышает титр агглютинации эритроцитов исходного штамма E.coli M17, которая обеспечивается собственными маннозорезистентными гемагглютининами/адгезинами этого штамма.

Пример 3. Определение специфической безвредности рекомбинантного штамма.

Безвредность сконструированного штамма была изучена на модели белых мышей и кроликов-сосунков. Белых мышей заражали внутрибрюшинно 1 мл суспензией клеток в дозе 1×10⁷ м.т. За период наблюдения (7 дней) гибели зараженных животных не наблюдалось, физиологические показатели оставались в норме. По истечении указанного времени животных забивали и определяли наличие макроскопических изменений в кишечнике. У всех опытных животных не было отмечено никаких макроскопических изменений в толстом кишечнике скопления жидкости в просвете слепой кишки и прилегающих к ней отделов. Кроликов-сосунков заражали внутрикишечно и внутрижелудочно в дозах 1×10⁹ и 5×10⁹ м.т. Животных наблюдали в течение 4 суток. Установлено, что введение рекомбинантного штамма E.coli KM148 не приводило к развитию диареи или гибели животных. У всех забитых животных не наблюдалось ни макроскопических, ни микроскопических изменений.

Пример 4, отражающий иммуногенные свойства.

Для изучения иммуногенных свойств рекомбинантный штамм E.coli KM148 внутрижелудочно вводили взрослым кроликам в дозе 5×10 м.т. Антигенное действие изучаемого штамма определялось путем выявления в сыворотке крови антиадгезивных и антитоксических антител. Накопление указанных антител определяли в динамике (сыворотку крови от животных получали на 7, 14, 21, 28, 35, 42 и 49 дни). Иммунизацию проводили двукратно с интервалом в 28 дней. Полученную сыворотку для удаления гетерологичных антител сорбировали клетками исходного штамма. По результатам высокочувствительного ДОТ-иммуноанализа (качественный метод) сыворотки иммунизированных животных содержали антитела как к адгезину CFAI, так и к В-субъединице холерного токсина. Количественная оценка образования изучаемых антител проводилась с помощью развернутой реакции агглютинации в пробирках (определение антител к адгезину CFAI) и иммуноферментного метода ELISA (определение антител к В-субъединице холерного токсина).

Данные реакции агглютинации клеток диплазмидного штамма E.coli KM148, обусловленной взаимодействием их адгезина CFAI с соответствующими антителами, свидетельствует о присутствии антител к адгезину CFAI в высоких титрах (1:6400).

При определении уровня антител к В-субъединице холерного токсина при помощи иммуноферментного метода EL1SA было выявлено, что максимальный титр (1:3200) антитоксических антител регистрировался на 35 день иммунизации и сохранялся на протяжении всего срока наблюдения.

Таким образом, заявляемый штамм обладает высоким уровнем продукции В-субъединицы холерного токсина и адгезина (CFAI), являющимися основными протективными антигенами, обеспечивающими формирование антитоксического и антиколонизирующего иммунитета. Штамм безопасен для лабораторных животных независимо от способа введения в организм. Указанные свойства рекомбинантного штамма E.coli KM148 свидетельствуют о том, что штамм может рассматриваться как потенциально вакцинный для иммунопрофилактики колибактериоза и холеры, а также может использоваться как штамм-продуцент протективных антигенов, используемых при разработках диагностических тест-систем для выявления указанных антигенов в других штаммах и профилактических препаратах.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен штамм E.coli КМ148, продуцент протективных антигенов В-субъединицы холерного токсина и фактора колонизации CFAI, способствующих формированию антитоксического и антиколонизирующего иммунитета. Штамм создан на основе авирулентного штамма E.coli М17. В его клетки конъюгативно вводили рекомбинантные плазмиды pIEM3 (Km^rTc^r) с клонированным геном холерного токсина (ctxB) и плазмиду pCFA1(Tp^r) с генами, ответственными за колонизацию кишечника (cfa1). Предложенный штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ “Микроб”. Штамм обладает высоким уровнем продукции В-субъединицы холерного токсина и наличием адгезина CFAI. Штамм может быть использован для иммунопрофилактики колибактериоза и холеры, а также для создания новых диагностических тест-систем, позволяющих выявлять протективные антигены в других штаммах и в холерных профилактических препаратах.

Штамм бактерий E.coli, депонированный в Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ “Микроб” (г. Саратов) под номером KM 148 - продуцент протективных антигенов: В-субъединицы холерного токсина и фактора колонизации CFAI, используемый для иммунопрофилактики колибактериоза и холеры.