Способ получения 1-нитро-9-оксиалкиламиноакридинов или их хлоргидратов Советский патент 1985 года по МПК C07D219/12 

3

Вьшавший оранжевый осадок вьжрйс- таллизовьшался из метанола с добавкой эфира. Получен хлоргидрат 1 нитро-9(1-гидроксибутило)аминакридина с т,пл. с разложением. Выход 90%.

Хроматографический анализ.

На нейтральной окиси алюминия (фирмы Мерк) по системе бензол:ацетон:метанол (3:1:1) Rf 0,65.

На силикагеле (фирмы Мерк) по системе бутанол:уксусная кислота вода (4:1:1) Rf - 0,50.

Вычислено, %: С 58,67; Н 5,21; N 12,08.

Найдено, %: С 58,69; Н 5,20; N 12,16.

Группа соединений согласно кзоб ретению обладает противоопухолевой активностью, которая является подобной, а в большинстве тестов даже более высокой по сравнению с известным соединениями этой группы. Кроме того предлагаемые соединения не проявляют рвотных .свойств, а также не влияют на периферическую кровь.

Противоопухолевые свойства рассматриваемой группы соединений, а именно 1-нитро 9-гидроксиалкиламиноакридинов, многократно исследовались описаиньми тестами in vitro и in viv

Метод in vitro.

Торможение прорастания семян сердечника - тест роста.

На чашке Петри диаметром 80 мм помещают по возможности равномерно ЗО- 25 семян сердечника на двух слоях промокательной бумаги. Затем на чаовк .наливают 30 мл раствора исследуемого соединения с концентрацией 1 мг/мл, а на контрольные чашки - дистиллированную воду. Чашки инкубируют в течение суток при 20-30°С, после чего измеряют длину ростков.

Эффект торможения выражается в процентах уменьшения средней длины исследуемых ростков по сравнению с контрольными.

Процент торможения прорастания семян сердечника для рассматриваемой группы соединений 87-94%.

Метод Миямура (раковые клетки Эрлиха).

Метод заключается в определении торможения активности дегидрогеноз раковых клеток Эрлиха (5x10 в мл) исследуемыми соединениями, мерилом

2620

чего является диаметр зоны невосстановленного окислительно-восстановительного красителя (ресазурина), образовавшийся вокруг цилиндра с I%5 ным раствором исследуемого соединения после пятичасовой инкубации при 87С.

Соединения, для которых зона торможения составляет не менее 20 мм, О считаются активными.

Рассматриваемые соединения выявляют исключительно высокую активность в этом тесте, причем она составляет в среднем 31-33 мм. 5 Тканевая культура (линия KB),

Исследования проводились по методу тканевой культуры, разработанному Иглем и Фоули, модифицированному Смитом и его сотрудниками. 0 Опыт проводился на опухолевых клетках человеческого происхождения с так называемой лииии КБ с использованием питательной среды Игла с добавкой 10%-ной телячьей сыворотки. 5 Тесты производились в пробирках, прививаемых 4 мл взвеси f40-80 тыс. клеток), что равнозначно с 40-80 мг клеточного белка.

Рост культуры определялся приросд 1том клеточного белка; Это определение проводилось фотометрически с использованием реактива Фолина-Сикаль- тана методом, разработанным Оямой и Др.

Одновременно с привитием пробирок клетками добавлялось 0,9 мл водного раствора исследуемого соединения таким образом, чтобы концентрация составляла: 100; 10; 1; 0,1; 0,01; 0,001; и 0,0001 мг/мл питательной среды. Пробирки инкубировались при 37°С. По истечении 72 ч определялся прирост клеточного белка в пробирках, в которые добавлялся препарат, а также в контрольных пробирках.

Каждая концентрация исследовалась параллельно по двум пробам.

Определялись такие концентрации вещества, которых обеспечивается 0 то{жожение прироста клеточного белка на 50% - LD 5д ипи EDj .

Процент торможега я рассчитывался

по формуле:

5 Остаточное количество клеточного белка цо контролю - концевое количество белка клеточного в тесте

% торможения 100 Остаточное количество клеточного белка по контролю - начальное количество клеточного белка по контролю. В соответствии с общепринятыми нормами активными считаются такие соединения, в которых 1 ц м/мл, Соединения I тестировались этим методом несколько раз. Например, ED 5Q для одного препарата этой группы,с кодовым символом С-857, т.е. 1-нитро-9--гидроксиэтиламинакрИ дина, составляет О,0007рг/мл, Метод in vivo. Торможение роста мьшиной сарко-; мы Крокера (Sa-t80). Для опытов применялись мьши в возрасте около 3 мес. весом около 25 г. Их прививали срезом опухоли (За-180) и делили на группы: одну контрольную - 18 штук и две до четырех групп леченных по восемь штук каждая. Исследуемые соединения в соответствуюпщх дозах вводились в брюшину после предварительного определения максимально переносимой дозы (MID). В качестве оценки противоопухолевого действия исследуемых соединений, принималась процентная разница -между средними весами опухолей контрольных мышей и мышей, получающих препарат, с учетом пр этом токсических эффектов исследуемого соединения. Оценка токсичности охватывает потерю веса леченных животных по сравнению с контролем, число павших животных с контролем, а также микроскопические гистопатологические иссл дования. Активными считаются такие соединения, которые по крайней мере дважды тормозили рост опухолей более 40%, не вызывая при этом ни падежа животных(2 штук), ни средних потерь веса(4 г). Исследования in vivo в этом тест рассматриваемой группы соединений . проводились многократно. Так, например, для препарата с кодовым символо С-857, т.е. 1-нитро-9-гидроксиэтиламинакридина, установлено торможение роста саркомы Sa-lBO в зависимости о следующей дозы: при дозах 0,2-0,8 мг /кг процент торможения составлял соответственно 44-86. Подобным образом для препарата, обозначенного символо С-934, т.е. 1-нитро-9-гидроксибутиламинакриди а, при дозах 0,2-0,4 процент : торможения составлял 45-60. Фармакологические исследования. Проводились исследования токсичности острой и кумулятивной, а также основных фармакологических свойств в следующих тестах: острая токсичность и определение максимально переносимой дозы; кумулятивная токсич- . ность; влияние на систему кровообращения; влияние на гладкие мышцы; влияние на центральную нервную систему; иммуносупрессивное действие. Острая токсичность (LD fp ) и максимальная переносимая доза (MTD) определялись на крысах Wiater, кроликах (обоего пола) и на мышах Albino Swiss (самки). . Соединения вводились в брюшину (у всех трех видов животных) и в желудок (у крыс и кроликов). Продолжительность наблюдения составляла 48 ч. В табл. 1 приведены следующие значения LD 50 и MTD при введении соединения С-857. Таблица 1 Мьшь 23,4 15 Крыса 9,2 7,5 69,1 30 Кролик 11,4 7,5 69,0 20 . Кумулятивная токсичность. Опыт проводился на нескольких группах крыс (iio 20 шт.) , которым исследуемое соединение вводилось в течение 14 14 дней в дозах, представляющих собой 1/100 . Затем животные умерщвлялись, после чего производилась микроскопическая оценка мышечных органов и брюшной полости. Следует полагать, что исследуемый препарат кумулируется в минимальной степени - смертельность животных, получавших лекарство, по сравнению с контролем составила около 5%. Не наблюдались также ни потеря веса животных, ни изменения в их внешнем виде и поведении. 7 Исследование, касающееся влияния на систему кровообращения и гладкие мьщ1цы, проводилось на крысах, которым вводилось соединение С-857 в до зах от 0,01 до 20 мг/кг. Препарат не вызывал заметных изменений иссле дуемых сердечно-сосудистых параметров, т.е. не влиял на артериальное давление, на частоту деятельности сердца, не моделировал кривой ЭКГ и не влиял на частоту и амплитуду дыхания. Лишь в самой высокой дозе (20 мг/кг) препарат выявлял слабое спазмолитическое действие на кишку и мочевой пузырь крысы in situ. Препарат не выявлял заметного и направленного действия на центральную нервную систему. В дозах 1/20- 1/2 LDjQ он не выявлял болеутоляюще го и антиконвульсивного действия и .с щественного торможения подвижности, но наблюдалось незначительное влияние на гексобарбиталовый наркоз. 08 Препарат лишь после многократного введения в дозах около 1/5-1/It) LDj-Q выявлял иммуносупрессивное действие, проявляющееся в тестах: контактная сенсибилизация пикрилхлориду, местная клеточная реакция типа трансплантат против реципиента, а также миожет ственное воспаление суставов. Исследование подострой токсичности препарата С-857 проводилось на кроликах, которым в брюшину впрыскивался препарат в дозе 1/120 U)Q. После 21 дня было установлено незначительное снижение абсолютного ве- са селезенки и печени, а также рост числа лейкоцитов. Остальнь1е гематологические определения не отличались от опр1еделений, выполненных у нормальных животных. В табл. 2 представлен сопоставительный анализ биологических исследований, Ледакрина с соединениями 1 при внутрижелудочным введении препарата. Таблица 2

1, Способ получения 1-нитро-9-оксиалкиламиноакридинов общей формуN02 МН-СН(СН2)лОН лы где при R - Н, п 1, 2 или 3; при R - CgHy, п 1, или их хлоргидратов, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что раствор 1- -нитро-9-феноксиакридина в феноле об рабатывают оксиалкиламином или его хлоргидратом при их .соотношении . после чего нагревают до 60-100 С, полученную смесь охлаждшот и выливают в избыток неполярного органического растворителя, выпавший осадок о.т- фильтровьшают и кристаллизуют из безводного полярного органического растворителя или их смеси с последующим S выделением целевого продукта в свободном виде или в виде хлоргидрата. W 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве неполярных органических растворителей используют этиловый эфир или бензол а S в качестве полярных растворителей при-j меняют метанол, этанол или их смесь.