Меченный тритием хлорид тетрафенилфосфония в качестве индикатора на мембранный потенциал Советский патент 1986 года по МПК C07F9/54 A61K31/66 

I

H3o6peTekHe относится к химии фос форорганических соединений с С-Р связью, а именно к новому соединению - меченному тритием хлориду тет- рафенилфосфония формулы

C TgP CeHsbcr,

которьй может быть использован для определения мембранного потенциала митохондрий.

Цель изобретения - Ловьппение точности определения мембранного потенциала митохондрий и снижение токсичности индикатора на мембранный потенциал.

На чертеже представлена реакционная система для синтеза меченного тритием хлорида тетрафенилфосфония.

Пример. Получение меченного тритием хлорида тетрафенилфосфония.

В ампулу 1 через перетяжку 2 загружают « 5 г зерен кварца размер ом 100-200 ) с предварительно нанесенным на его поверхность насыщенного спиртового раствора 20-30 мг NaCl, а затем 20 мг трифенилфосфина из бензольного раствора. В ампулу вводят 50 мкл гексатритийбензола с удельной активностью 2 Ки/мл. Перетяжку 2 перепаивают и реакционную систему выдерживают при 5°С (твердая фаза) в течение 10-15 сут для накопления продукта реакции. Затем с помощью магнитного бойка 3 разрушают перегоСравнение хроматографического проведения

(C6TsP(CgHs)j;cr и (()4r

на силуфоле (silufol uv-254)

(C6TsP(CgH5)3 )0,18+0,02 0,17+0,02 0,19+0,01

(CgHs),P)Cr

78612

родку 4 и непрореагировавший бензол Перегоняют в новую реакционную ампулу 5. Из ампулы 1 целевой продукт вы- мьюают 5 мл воды. Выход 85+5%. Ана- 5 ЛИЗ полученного продукта проводился по методам тонкослойной хроматографии и многократной перекристаллизации.

Из ампулы 1 нёпрореагировавший

О гексатритийбензол (взятый в 5 кратном мольном избытке) перегоняют в новую реакционную ампулу 5, в кото-, рой находятся зерна кварца 5 г (.размером 100-200) с предваритель5 но нанесенным на их поверхность

20-30 мг NaCl, а затем 20 мг (. Ампулу запаивают и вьщерживают при О с (снег) в течение 10-15 сут для накопления продуктов реакции, после .

0 чего ампулу вскрьюают. Отогнанный тритированный бензол пригоден для нового синтеза меченного тритием хлорида тетрафенилфосфония. Получен- ньй целевой продукт вымьшают через

5 зерна кварца - 3-5 мл Н.0 (бидистил- лят. Выход 86+3%.

Хроматографический анализ полученного соединения показал его полную идентичность.немеченному хлориду тет0 рафенилфосфония.

Результаты тонкослойной хроматографии полученного соединения и нерадиоактивного хлорида тетрафенилфосфония представлены в табл.1.

Таблица 1

3

Дополнительные доказательства ониевой структуры соединения фосфора получены на основании постоянства массовой активности при многократной перекристаллизации полученного продукта в присутствии нерадиоактивного хлорида тетрафенилфосфония

Для определения мембранного по- тенциАла митохондрий при помощи проникающего липофильного катиона тетрафенилфосфония, взятого в виде хлористой соли, использовали митохондрии печени белой крысы, выделенные по известной методике. Суспензия митохондрий представляла собой изотонический раствор саха:розы 0,25 моль/л и Трис-С1 буфер, рН 7,4. Исходная суспензия содержала митохондрии в .концентрации около 50 мл белка/мл. Для проведения опыта аликвота суспензии разбавлялась аналогичной средой в 100-200 раз. Затем производилась преинкубация рабочей суспензии (

со всеми ингредиентами, кроме радиоактивного катиона. Хранение митохонд рий и все опыты проводились при 0°С. Преинкубация была необходима для достижения стационарного распределения всех катионов между митохондриями и средой. Затем вносился радиоактивный катион тетрафенилфосфония (ТФФ) и изучалась кинеФика его наИндикаторные свойства нового соединения, его структурного аналога и эталона при определении мембранного потенциала митохондрий Таблица 2

10

15

17861Л

копления в митохондриях. Для отделения митохондрий от среды применялось фильтрование через миллипоро- вые фильтры с диаметром порО,45мкм. г Митохондрии промьшались на фильтре нерадиоактивной средой. Затем производилось определение радиоактивности митохондрий и среды и вычислялись коэффициенты накопления ТФФ. Мембранный потенциал рассчитьшал- ся по формуле Нернста с использованием данных о равновесном распределении ТФФ.

Одним из критериев хорошей сохранности митохондрий является их способность длительное время поддерживать достигнутый уровень стационарного распределения проникающего катиона. В В опытах с ТФФ уровень накопления поддерживался в течение 1 ч и более. Никаких токсических эффектов ТФФ не обнаружено. Проведенное морфологическое изучение митохондрий при помощи электронного микроскопа показало, что в структуре митохондрий не обнаружено никаких изменений, которые можно было бы приписать действию нового препарата.

Сравнение индикаторных свойств нового соединения, его структурного аналога и эталона приведено в таблице 2.

20

25

30

Меченный тритием хлорид тетрафе- нилфосфоиия формулы CfeTsP CfcHsl Cr в качестве индикатора на мембранный потенциал. (Л jMr rV i // F ваму1/мти cuemfr a « и 1C 00 Од