Способ оценки токсичности водных сред Советский патент 1986 года по МПК G01N33/18 C02F3/34 

Изобретение относится к водной токсикологии и токсикогенетике и может быть использовано при тестировании промьщшенных и поверхностных сточных вод и химических соединений, загрязняющих окружающую природную среду.

Целью изобретения является ускорение, упрощение и повышение точности способа за счет оценки мутагенности.

Способ осуществляют следующим образом.

Двухсуточных дафний F экспонируют 24 ч в исследуемых растворах и далее содержат их и их потомков F

и

F, в чистой воде. За счет этого, для популяций потомков опытных и контрольных вариантов создают одинаковые условия поэтому можно обнаружить и учесть появление среди дафний второго поколения опытных и контрольных вариантов особей с морфологическими изменениями, оценить снижение продолжительности жизни и изменение плодовитости. Уменьшение плодовитости у второго поколения опытных вариантов по сравнению с контролем является следствием проявления летальных мутаций, индуцированных в гаметах родителей FJ, исследуемыми растворами; появление особей с морфологическими. iвменениями и снижение продолжительности жизни популяций потомков - следствием проявления индуцированных морфологических ,и полулетальных мутаций соответственно,снижающих приспособленность и вызывающих гибель на более ранних стадиях онтогенеза. При проведении анализа родословных некоторых дафний с морфологическими изменениями доказано, что обнаруженные изменения морфологии антенн, ан- теннул и др, наследуются и, следовательно, являются мутациями, а не мо- дификациями.

Пример 1, Одновозрастных дафний - потомков одной партеногенети- чески размножающейся особи инкубир у- ют до появления у них потомства, затем отбирают двухсуточных особей и используют в опыте, помещая по 10 особей в каждый из аквариумов опытной серии, содержащих по 500 мл растворов N - НММ (N-нитpoзo-N-мeтил- мочевины) и концентрация 100, 50, 10 5,1 и О, мг/л, и контрольной серии с чистой водой. Через 24 ч живых осо- бе переносят в .аквариумы с чистой

6770J

водой и содержат до 20-суточного возраста, Дпя слабых токсикантов и слаботоксичных койцентраций время экспонирования увеличивают от 24 до 96 ч,

5 , а для высокотоксичных уменьшают от 24 до 6 ч. Двадцатисуточный период наблюдений за дафниями, начиная с момента их рождения, является оптимальным и достаточным для получения необ ходимой информации. Кормят дафний ежедневно хлореллой. На каждый из опытных и контрольных вариантов заполняют протоколы, в которых фиксируют . необходимые для оценки токсичности

15

20

25

30

35

40

45

сведения о состоянии особей F . В каждом из протоколов указывают количество особей в начале и в конце экспозиции и, начиная с 6-суточного возраста - наступления половозрелости, ежедневно отмечают количество живых особей F и количество появившихся потомков F, .

Появившихся Одновозрастных потомков F, переносят в отдельные аквариумы с чистой водой для получения потомков второго поколения F , Последних также Одновозрастных переносят в отдельные аквариумы с чистой водой. На каждый из аквариумов с особями второго поколения заполняют протоколы, в которых ежесуточно фиксируют сведения, необходимые.для оценки мутагенности: количество живых особей, количество появившихся потомков, количество потомков с морфологическими изменениями. Регистрацию показателей у особей второго поколения прекращают по достижении дафниями 20-суточ- ного возраста.

Для оценки токсичности испытуемых растворов N-HMI i в каждом из опытных вариантов для F рассчитывают процент гибели особей за период экспонирования в растворах,(за 24 ч),

, (..i22

N

где N

50

количество особей в начале

экспозиции;

количество особей, выживших

к концу экспозиции; процент гибели особей за весь период наблюдения

,

х

(N - п,о) . N

100%

где N - количество особей в экспозиции;

начале

n д- количество живых особой в . конце наблюдений (20-суточ- ных);

среднюю плодовитост ь па одну выжившую условног1лодовитую самку „ .

Для расчета Р чиЛю всех потомков F , появившихся за период с 6 до 20 дней наблюдений (iF ), относят к среднесуточному, числу условноплодовитых самок

(

I 15

где

5 -20сумма чисел в протоколах,указывающих количество живых дафний в дни учета с шестых до двадцатых суток, а 15.- число дней наблюдений за условноплодовитыми особями 1 , Таким образом, Р, рассчитывают по формуле

IF, Гн.

15

Ь-70 .

Коэффициенты Z и К, рассчитанные для каждого варианта опыта, позволяют количественно оценить степень токсичности разных концентраци агентов по таким показателям как гибель и плодовитость.

, Коэффициент гибели (Z) рассчитывают как отношение процента гибели в опытном варианте к проценту гибели в контроле

г

о у

И К

Коэффициент плодовитости (К рас- считьгеают как отношение плодовитости особей опытного варианта к плодовитости особей контроля

К .--pji

% . р

о - к

в табл. 1 представлены данные о токсичности N-HMM, рассчитанные по- результатам двух повторностей опытных и контрольного вариантов для D, magna при экспозиции 24 ч.

Концентрации N-HMM 100 мг/л и мг/л являются острртоксичными для D.magna: все особи погибают во время экспонирования в растворе и Z 14,9

Растворы N-ffMM в концентрациях Юу 5j к 0,1 мг/л обнаруживают слабое специфическое токсичное действие на дафний. Токсические эффекты кон- ценграций 10-0,1 мг/л не обнаружены при оценке гибели особей во время экспонирования (лишь в отдельных случаях погибает на 2,5% особей больше.

0

5

0

5

0

чем в контроле). Гибель за весь период наблюдений увеличивается незначительно „ 1,5-0,37. Но стимуляция плодовитости в опытных вариантах по сравнению с контролем в 2,5-2,0 раза свидетельствует о неблагоприятном влиянии этих N-HMM на дафний.

Для высокотоксичиых концентраций N-HMM 100 мг/л и 50 мг/л оценить мутагенность нельзя, так как все экспонированные в растворах особи погибают, не оставив потомства.

От особей FJ, , экспонированных в растворах 10, 5,1 и 0,1 мг/л, получают соответственно 326, 415, 206 и 296 особей F.

Для оценки мутагенности испытуемых растоворов N-HMM, в которых экспонируют особей F для второго поколения (F ) рассчитывают показатели, характеризующие проявление морфологических, летальных и полулетальных мутаций.

Процент особей с морфологическими изменениями рассчитьгаают по формуле

1т, 100%

« . -S---, .

где m - количество особей f, с мор- фологическими изменениями;

NP - количество родившихся и про- анализированных особей Fj.

. Процент гибели особей второго поколения за весь период наблюдения (20 сут) рассчитывают по формуле

.(100%

n

- количество живых особей F.

F -2о

В конце наблюдений (20-суточных).

Этот показатель (х ) характеризует снижение средней продолжительности жизни анализируемых популяций.

Средняя плодовитость на одну выжившую условноплодовитую самку за I5-суточный период наблюдений рассчитывают по формуле

rip., 15

ГДР

Р(

Г FJ - число всех потомков,

родившихся за 15 суток наблюдений, от самок второго поколения;

n - сумма чисел в протоко- лах, указьгеающих количество живых дафний второго поколения (F ) в дни учета;

I5 - количество дней Наблюдений (количество дней« в течение которых ведется наблюдеиие за полово- зрелыми самками: от 6-суточного возраста до 20-суточного).

Коэффициенты fi , 2р и К, рассчй- танине для каждого варианта опыта, позволяют количественно оценить мутагенность разных концентраций агента.

Коэффициент Н рассчитывают как отношение величины появления морфоло- гических мутантов в опытном варианте (М) к спонтанному уровню (S) или к контролю (М„)

ГУ

-

М

или

-Йал- М„

Спонтанный уровень появления морфологических мутантов рассчитывают при анализе рыборки около 10000 особей и составляет 0,0003%, что соответствует 3 10 .

Коэффициент ZP рассчитывают как отношение процента гибели особей Fg в опытном варианте (х ) к проценту

гибели в контроле (Хр

у5li 3.

X

Коэффициент Кр рассчитывают как отношение плодовитости особей F, в опытном варианте ( плодовитости особей в контроле (Рр )

.К.

-а...---.

В табл. 2 представлены данные о мутагенной активности низких концентраций N-ГОМ - известного супермутаге

Данные табл.2 свидетельствуют о

наличии слабого мутагенного действия испытываемых растворов N-HMM. чивается появление во втором поколении морфологических мутантов на 3 порядка по сравнению со спонтанньм уровнем; незначительно (в 1,25 - 2,03 раза) увеличивается гибель и существенно (в 2-4 раза) снижается

плодовитость особей F опытных вариантов по сравнению с контролем.

Таким образом, N-HMM обладает токсичным и мутагенным действием на Daphnla magna Straus. Лимитирующим показателем является мутагенность. Даже минимальная (0,1 мг/л) концент- ра1щя индуцирует значительное количество морфологических, полулетапь- ньпс и летальных мутаций,

Пр и М е р-2. Исследуют токсичное и мутагенное действие этнлметан- Сульфоната (ЭМС) - известного супермутагена, вызыванлцего мутации замены пар ох:нований за счет реакций ал- килирования и обладающего меньшей токсичностью, чем N-HMM.

В табл. 3 представлены данные, характеризующие токсичность, а в табл. 4 - мутагенность растворов ЭИС для Daphnia magna Str,

Концентрации 1000-400 мг/л являются остротоксичными: все экспонированные особи погибают, не оста- ,. вив потомства; Е 14,99. Концентрации 300-200 мг/л являются среднеток- сичными. Они индуцируют гибель незначительной части от числа обработанных особей, стимулируют их плодовитость. Более низкие концентрации (100, 10, 1 и 0,1 мг/л) обнаруживают специфическое токси ное действие на D.raagrta: стимулируют .плодовитость по сравнению с контролем в 1,84 - 2,46 раза и не увеличивают гибель.

Концентрации ЭМС 300, ЮО, 10, 1 и О,1 мг/л, обладающие умеренным токсичным действием или не токсичные для D.magna индуцировали морфологи- Ческие, летальные и полулетальные мутации, которые проявлялись в попу ляциях потомков (F. ), полученных от обработанных особей, Мутагенносч-ь выражалась в увеличении процента особей с морфологическими нарушениями на 2-4 порядка по сравнению со спонтанным уровнем; в уменьшении продолжительности жизни (процент гибели . в популяции F увеличивался в 1,47 - 3j27 раза для концентраций 300, 100 и 10 мг/л и не увеличивался для более низких концентраций); в резком снижении плодовитости

Таким образом, этилметансульфонат обладает токсичным и мутагенным действием. Лимитирующим показателем является мутагенность. Даже низкие концентрации (1 и 0,1 мг/л) индуцируют у дафний значительное количество морфологических мутантов и летальных мутаций, приводящих к значительному (в 7-50 раз) снижению плодовитости..

II р и м е р 3. Исследуют- токсичное и мутагенное действие неразбавленных и разбавленных (1:1, 1:5, 1:20 и 1:100) промстоков Байкальского целлюлозно-бумажного комбината, о которых известно, что они обладают умеренным токсичным и слабым мутагенным действием.

В табл. 5 представлены данные, характеризующие токсичность неразбавленных промстоков на Daphnia tnag- na Str., a в табл. 6 мутагенное действие этих промстоков при экспозиции 24 ч.

Неразбавленные и слаборазбавленные промстоки обнаруживают среднее специфическое токсичное действие на дафний: не вызывают гибели обработанных особей, но стимулируют их пло .довитость в 2-2,3 раза по сравнению с контролем.

Неразбавленные и слаборазбавленные промстоки индуцируют у дафний умеренное количество морфологических летальных и полулетальных мутаций., При разбавлении промстоков их мутагенность снижается: уменьшается количество выявляемых летальных и полу- летальиых мутантов. Промстоки, разбавленные в отношении 1:20 и 1:I00 незначительно увеличивают (в 1,А7 - I,41 раза) гибель особей второго по- коления. При разбавлении 1:5 и более плодовитость в опытных вариантах снижается в F по сравнению с контролем менее чем в 2 раза (К 0,54 - 0,6i табл. 6).

Таким образом, промстоки обнаруживают слабое токсичное и мутагенное действие на Daphnia magna Str. Лимитирующим показателем является мутагенность. Даже разба:вленные в 100 раз промстоки способны индуцировать возникновение морфологических мутаций.

Более чем 100-кратное разбавление вероятно, является биологически безопасным.

П р и м е р 4. Способ проводят аналоги151но примеру 1, используя вет- вистоусых рачков - Daphnia pulex.

Токсичное действие N-иитрозоди- метилмочевины на Daphnia pulex представлено в табл.7.

.

Растворы N-нитрозодиметилмочевины (N-ДММ) в концентрациях 1000 - 50 мг/л являются для D.pulex остротоксичными: Z 59,88; в концентрации 30 мг/л N-ДММ обладает средним токсичным действием: Z 29,94 и К„ 0,76.

Растворы.N-ДММ в концентрациях 10-0,1 14Г/Л обнаружили слаботоксичное специфичное действие на D.pulex: при незначительной гибели, отмечена стимуляция плодовитости выжившей час ти популяции - Zg о - 5,99.и К, 1,34-1,62.

Токсичное действие N-нитрозоме- тилмочевины на Daphnia pulex представлено в табл.8.

Растворы N-HMM в концентрациях 200-50 мг/л являются острртоксичными для D.pUlex: все особи погибают в течение экспонирования в растворе, г, 59,88.

Растворы 30-5 мг/л слаботоксичны: отсутствие погибших особей сопровождается пониженной плодовитостью обработанных само.к (2„ О и К„ 0,46 - 0,58).

Специфичное действие N-HMM в кон- центрации 1 мг/л: при 2„ 11,98 (повьш1ение токсичности), плодовитость выжи1вших нормализуется и практически не отличается от контроля (К 0,86). Сопоставление показателей позволяет считать 1 мг/л также слаботоксичным раствором.

Ф о рмула изобретения

Способ оценки токсичности водных сред, включающий экспонирование дафний в тестируемом растворе, регистрацию физиологического состояния и сравнение полученных результатов, отличающийся тем, что, с целью ускорения, упрощения и повышения точ ности способа оценки токсичности сточных вод и химических соединений за счет оценки мутагенности, после экспонирования дафний переносят в чистую воду, где содержат их и их потомков до 16-22-суточного возраста, регистрируют гибель обработанных дафний и плодовитость выживших осрбей, учитывают во втором поколении появление индуцировайных морфологических, летальных и сублетальных мутаций, определяемых соответственно по появлению особей с измененной морфологией тела, уменьшению плодовитости и продолжительности жизни, сравнивают показатели гибели обработанКонтроль 0,00

Спонтанный уро- 0,0003% вень (3-tO M

ных , показатели плодовитости и показатели мутагенности, при этом в качестве показателя гибели, плодо- 5 витости используют отношение этих показателей в одыте к контролю, а в качестве показателя мутагенности ис- , пользуют отношение определяемых мутаций в опыте к контролю.

т в я « В I

Таблица2

Спонтан- 0,0003%1

ный уро- (3 10 ) вень

Т a б л и ц. a 4

0,54

1,49+0,54

1,34+0,59

0,795+0,165

0,12+0,04 6,59

Таблица 5

15

1234770

16 Продолжение табл.5

Изобретение относится к водной токсикологии и 1токсикогенетике и позволяет ускорить, упростить и повысить точность контроля за счет оценки мутагенности. Экспонируют двух суточных дафний D тестируемом растворе 24 ч, затем переносят их в чистую воду, где содержат и их потомков до 16-22-суточного возраста. Регистрируют гибель обработанных дафний и пло , довитость выживших особей. При этом учитывают во втором поколении появление индуцированных морфологических, летальных и сублетальных мутаций,оп ределяемых соответственно по появлению особей с измененной морфологией тела, уменьшению плодовитости и продолжительности жизни. Сравнивают показатели гибели обработанных дафний, показатели плодовитости и показатели мутагенности, причем в качестве этих показателей используют их отношение в опыте к контролю, а в качестве показателя мутагенности используют.отношение мутаций в опыте к контролю. 8 табл. с S (Л с