Способ получения бактериального концентрата мезофильных молочно-кислых стрептококков Советский патент 1986 года по МПК A23C9/12 C12N1/20 

Изобретение относится к технической микробиологии, а именно к получению бактериального концентрата, используемого для приготовления производственной закваски, рлинуя лабораторную, и для непосредственного приготовления продукта - творога, сметаны, простокваши обыкновенной.

Целью изобретения является повышение содержания бактериальных клеток мезо- фильных молочно-кислых стрептококков в концентрате и увеличение стойкости его при хранении.

На фиг. 1 дана зависимость клеток мезофильных молочно-кислых стрептококков после замораживания и высушивания в зависимости от различного содержания сахарозы в суспензии; на фиг. 2 - то же, при содержании в суспензии 1,6% сахарозы и различном содержании лимонно-кислого натрия; на фиг. 3 - то же, при содержании в суспензии 1,6% сахарозы, 4% лимоннокислого натрия и различном содержании крахмала; на фиг. 4 - то же, при содержании в суспензии 1,6% сахарозы, 4% лимонно-кислого натрия, 12% крахмала и различном содержании фитина.

Способ предусматривает приготовление питательной среды на однове молочной сыворотки с добавлением аминокислотно-мик- роэлементно-витаминного комплекса - амми- вита в количестве 0,5-0,8% буферных солей, микроэлементов, внесением закваски, культивирование с регулированием рН, выделение биомассы клеток из культуральной жидкости и смешивание ее с зап итной средой, содержащей фитин. На стадии культивирования в питательную среду вносях 1% обезжиренного молока, 0,3% гидролизата казеина и 0,00015% пепсина. В заш,итную среду дополнительно вводят сахарозу, лимонно-кис- лый натрий и крахмал. Соотношение биомассы выделенных клеток и защитной среды устанавливают соответственно равными от 1:2 до 1:4.

При этом содержание сахарозы, лимоннокислого натрия, крахмала и фитина в полу- чепной суспензии составляет 1,33-16; 3,33- 4; 1,0-1,2; 0,13-1,16% соответственно.

Предпочтительно при осуществлении способа после смешивания биомассы выделенных клеток с защитной средой проводить замораживание с последующей сушкой при температуре - 35°С вначале процесса и 30°С в конце процесса.

Целесообразно сахарозу, лимонно-кис- лый натрий, крахмал и фитин вводить в защитную среду соответственно в количествах 2,5; 1,5 и 6,2%.

.(Наксимальное увеличение роста клеток на 12-25% наблюдалось при внесении аммивита в количестве 0,5-0,8% от массы среды.

При внесении аммивита в количестве 0,8-1,5% от массы среды дальнейшего увеличения роста клеток не происходит. .Лмми0

0

0

5

0

5

0

5

вит имеет очень низкое рН и при его внесении значительно снижается рН среды культивирования.

Кислотный гидролизат казеина содержит не только аминокислоты, но также пептиды и другие фракции белка, которые необходимы для роста микроорганизмов. Опытным путем установлено, что оптимальным является добавление в среду в процессе культивирования 0,3% гидролизата казеина. Большее количество гидролизата казеина тормозит рост мезофильных молочно-кислых стрептококков, а меньшее дает увеличение количества клеток всего на 10-15%.

Цепсин является протеолитическим ферментом животного происхождения, который проводит гидролиз белков молока до аминокислот, которые хорошо усваиваются мезо- фильными молочно-кислыми стрептококками и стимулируют их рост.

Введение в среду пепсина является сообразным лишь в сочетании со стерильным обезжиренным молоком. Оптимальным является введение в среду 0,00015% пепсина и 1% обезжиренного молока. Среда обогащается серосодержащими дикарбоновыми ароматическими аминокислотами.

Содержание незамени.мых аминокислот значительно увеличивается - лизина в 2,5 раза, метионина в 1,7 раза, валина в 1,2 раза, фенилаланина в 5,2 раза.

При внесении 1,5% обезжиренною молока количество незаменимых аминокислот увеличивается и количество клеток увеличивается на 18-20%.

При внесении 0,6-0,8% обезжиренного молока количество клеток увеличивается всего на 9-12%. Внесение большего количества пепсина не дает заметного увеличения содержанию аминокислот, а снижение его количества приводит к недостаточному гидролизу белков молока, что отрицательно влияет на рост клеток.

При соотношении биомассы и защитной среды 1:4 содержание сахарозы в защитной среде соста зляет 2%, лимонно-кислого натрия 5%, крахмала 1,5%, фитина 0,2%.

При соотношении биомассы и защитной среды 1:2 на 12 кг биомассы берут 24 кг защитной среды и полученная суспензия в количестве 36 кг содержит 1,33% сахарозы, 3,33% лимонно-кислого натрия, 1 % крахмала и 0,13% фитина.

Зан1.итные среды устраняют вредное действие кислорода, не дают пересыхать бак- концентрату, регулируют осмотическое давление., как внутри клетки, так и вне ее.

Устойчивость клеток к замораживанию и высушиванию в значительной степени зависит от природы и концентрации крио- защитных веществ, содержащихся в защитных средах.

При исследовании выживаемости мезофильных молочно-кислых стрептококков в защитной среде, содержащей различные количестна сахарозы, лимонно-кислого натрия, крахмала, фитина, установлено, что эвтектическая зона суспензии клеток (смесь биомассы с защитной средой) находится в пределах от -25 до -35°С. При этом в суспензии клеток содержится сахарозы 1,33- 1,6%, лимонно-кислого натрия 3,33-4%, крахмала 1 - 1,2%, фитина 0,13-0,16%.

Согласно фиг. 1-4 самая высокая выживаемость клеток при замораживании и высушивании наблюдается при содержании в суспензии клеток указанного количества ком понентов.

Увеличение содержания компонентов в защитной среде приводит к снижению эвтектической зоны до температуры от -40°С до -45°С, продолжительность сушки увеличивается, количество клеток остается на прежнем уровне.

Опытным путем было установлено, что при температуре -35°С в начале сушки и при досушивании при -|-30°С отмечалась лучшая сохраняемость клеток в суспензии клеток (89-95%).

Снижение температуры в начале процесса сушки значительно увеличивает продолжительность сушки, а повышение температуры досушивания (до 35-40°С) приводит к большой гибели клеток (82-85%).

Пример 1. Для приготовления сухого бактериального концентрата мезофильных молочно-кислых стрептококков берут 260 л сыворотки из-под творога с рН 4,5, добав- л-яют 5 л аминокислотно-микроэлементно- витаминного комплекса и все нагревают в ванне ВДП до 93°С и выдерживают при этой температуре 60 мин.

Для приготовления 1000л среды сыворотку с аминокислотно-микроэлементно-витамин ным комплексом смешивают в ферменторе с 650 л питьевой воды и добавляют 10 кг лимонно-кислого натрия и 165 г. сернокислого марганца. Устанавливают реакцию среды 25%-ным водным раствором аммиака до рН 6,5,

После этого проводят стерилизацию при 118°С (давление 0,08 МПа) и выдерживают при этой температуре 60 мин, а затем охлаждают до 30°С. В подготовленную среду вносят 30 л закваски, приготовленной на стерилизованном обезжиренном молоке.

Через 3 ч культивирования в ферментер вносят 10 л стерилизованного обезжиренного молока, 1,5 г пепсина (предварительно растворенного в 100 мл стерильного физиологического раствора) и 3 л стерилизованного гидролизата казеина.

Выращивание мезофильных молочно-кислых стрептококков проводят в течение 10 ч в условиях периодического культивирования, поддерживая рН на уровне 6,5 путем постоянной нейтрализации среды 25%-ным раствором аммиака.

После окончания процесса культивирования культуральную жидкость охлаждают

0

5

0

5

0

0

5

0

5

ДО 10°С и направляют па бактофугирова- ние.

Из 1000 л среды получают 12 кг биомассы. В биомассе определяют количество клеток. Для этого берут две пробирки с 10 мл стерильной воды, подогретой до 30°С. В одну пробирку отвешивают 1 г биомассы, хорошо ее перемешивают с водой, так чтобы не было комочков. В другую пробирку наливают 1 мл рабочего раствора реза- зурина. Содержание двух пробирок соединяют в одну пробирку, закрывают резиновой пробкой, смешивают путем медленного трехкратного переворачивания пробирки. Пробирку помещают в водяную баню при 30°С. Обесцвечивание резазурина произошло за 1 мин. Поэтому биомассу смешивают с защитной средой в отношении 1:4. Защитной среды берут 48 кг. Защитная среда состоит из 4900 мл 20%-ного раствора сахарозы, стерилизованной при 112°С в течение 30 мин, 6000 мл 40%-ного раствора лимонно-кислого натрия, стериллизованного при 121°С в течение 15 мин, 13091 мл 5,5%-ного раствора крахмала, стерилизованного при 135°С в течение 2 ч и 24009 мл воды с внесенными в воду 96 г фит ина, стерилизованного при 135°С в течение 2,5 ч. Затем все составные части в асептических условиях сливают и получают 48000 мл защитной среды. Затем 12 кг биомассы смешивают в асептических условиях на системе с 48000 мл защитной среды.

Полученную смесь разливают во флаконы по 7 мл. Затем флаконы помещают па лотки и замораживают при температуре -50°С в течение 5 ч и сушат сублимационным методом при следующих режимах: начальная температура сушки -35°С, копечная температура досушивания +30°С, температура конденсатора минусовая, остаточное давление 1,1 Па, продолжительность сушки 36 ч.

Флаконы закрывают стерильными полиэтиленовыми пробками и закрывают алюминиевыми колпачками. Получают 6,5 тыс, порций сухого бактериального концентрата. В 1 г (порции) сухого бактериального концентрата содержится 350 млрд. клеток.

Пример 2. Для приготовления сухого бактериального концентрата мезофильных молочно-кислых стрептококков берут 260 л сыворотки из-под творога с рН 4,6, добавляют 5 л аминокислотно-микроэлементно-витамин- ного комплекса и все нагревают в ванне ВДП до 97°С и выдерживают при этой температуре 70 мин.

Затем сыворотку освобождают от белков сепарированием. Для приготовления 1000 л среды в ферментере смешивают 250 л осветленной сыворотки с аминокис 1отно-микро- элементно-витаминным комплексом с 650 л питьевой воды и добавляют 10 кг лимоннокислого натрия и 165 г сернокислого марганца. Устанавливают реакцию среды

25%-ным водным раствором аммиака до рН 6,8.

После этого проводят стерилизацию среды при 118°С (давление 0,08 МПа), и выдерживают при этой температуре 65 мин, а затем охлаждают до 30°С.

В подготовленную среду вносят 50 л закваски мезофильных молочно-кислых стрептококков, приготовленной на стерилизованном обезжиренном молоке.

Через 4 ч культивирования в ферментер вносят 10 л стерильного обезжиренного молока, 1,5 г пепсина (предварительно растворенного в 100 мл стерильного физиологического раствора)и 3 л стерильного гид- ролизата казеина.

Выращивание мезофильных молочно-кис- лых стрептококков проводят в течение 12 ч в условиях периодического культивирования, поддерживая рН среды на уровне 6,8 путем постоянной нейтрализации среды 25%- ным раствором аммиака.

После окончания процесса культивирования культуральную жидкость охлаждают до 8°С и напраи.:1яют на бактофугирование. Из 1000 л среды получают 10 кг биомассы.

Освет.пенн-, резазурина проходит за 3 мин. Поэтому бакконцентрат смешивают с защитной средой в соотношении 1:2, т.е. защитной среды 20000 мл.

Защитная с)ела состоит из 2000 мл 20%- ного раствора сахарозы, предв арительно стерилизованной при 0,05 МПа, что соответствует 114°С в течение 25 мин; 2500 мл 40%-ного раствора лимонно-кислого натрия, предварительно стерилизованного при 122°С в течение 12 мин; 5454,5 мл 5,5%-ного раствора крахмала, предварительно стерилизованного при 138°С в течение 2,5 ч и 40 г фитина, помещенного в 10045,5 мл дисСодерх ание / и/ онно-каслого нат/л/я фиг. 2

0

5

0

5

0

ТИЛЛИрованнои воды и все стерилизуют при 138°С в течение 2,3 ч. Затем все составные части в асептических условиях сливают и получают 20000 мл защитной среды. Затем 10 кг биомассы смешивают в асептических условиях на смесителе с 20000 мл защитной среды.

Полученную смесь разливают во флаконы по 6 мл. Затем флаконы помещают на лотки и замораживают при температуре -50°С в течение 6 ч и сушат сублимационным способом при следующих режимах: начальная температура сушки , конечная температура досущивания +30°С, температура конденсатора - 60°С, остаточное давление 0,45 Па, продолжительность сушки 28 ч.

Затем флаконы закрывают полиэтиленовыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками. Получают 4,5 тыс. порций сухого бактериального концентрата, в 1 г (порции) сухого бактериального концентрата содержится 300 млрд. клеток.

Порция концентрата в 1 г (после ее предварительной активизации) свертывает 2000л молока, подготовленного для выработки творога за 6-8 ч или 2000 л сливок при сквашивании за 12-14 ч.

Сухой бакконцентрат сохраняет свою активность в течение 4 мес. и в сравнении с жидким имеет более высокую стойкость и высокую активность, что позволяет его использовать непосредственно при приготовлении продукта.

Таким образом,изобретение обеспечивает повьииение содержания бактериальных клеток мезофильных молочно-кислых стрепто- кокков в концентрате и увеличение стойкости его при хранении.

Содер}моние фиг.З

Содержание q}t/f7 i///a фиг. 4

Составитель А. Горбачева

Редактор Г. ВолковаТехред И. ВересКорректор Л. Патай

Заказ 3633/5Тираж 543Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП «Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4