Способ получения @ -яблочной кислоты Советский патент 1986 года по МПК C12P7/46 

f

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу получения L-яб- лочной кислоты из фумаровой путем ферментативной гидратации последней под воздействием фермента фумаразы дрожжей.

Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта.

Способ осуществляют следующим образом.

J Превращение фумаровой кислоты в яблочную проводят с помощью обладающих фумаразной активностью свободны или иммобилизованных дрожжей Saccha romyces cerevisiae, Sacchaiorayces vi ni НЛИ Caiididy lipolytica.

Дрожжи подвергают предварительному активированию.

Для активирования С. lipolytica и Sacch.. vlni используют влажные биомассы, полученные после выращивания на среде с н -алканами (С. lipolytica) или мелассой (Sacch. vini), сепарирования и последующей промывки водой.

Для активирования Sacch. cerevisiae приготавливают смесь, содержащую, %: дрожжи 44,15-44,4i вода 44 15-44,4 i калий фосфорнокислый двухзамещенный 1,55-1,99; магний сернокислый 0,,26; фумаровая кислота 0,88-0,89 и гидроокись кали 0,88-0,90, рН смеси 7,2-7,4. Дрожжи в этом растворе инкуби- pysoT при 28-30 С и встряхивании в течение 18-22 ч. Затем добавляют 7,68-7,73% толуола и продолжают инкубировать при 35-39°С и встряхивании в течение 60-80 мин.

Активирование осуществляют путем выдерживания полученных биомасс дрожжей в замороженном состоянии, этого достаточно вьщерзсивать их йри температуре от -5 до -9 С.

определения активирования дрожжей ставят опыты с добавлением разшлх количеств субстрата реакции (фумаровой кислоты) в расчете на 1 сухой биомассы дрожжей. Об эффекте активирования судят по времени в течение которого не менее 80% фумаровой кислоты преврапщется в яблочную , а также по максимальному количеству образовавшейся яблочной кислоты в расчете на t г сухой биомассы дрожжей.

Результаты экспериментов пред- етавлены в табл. 1-3.

54004J

Как видно из таблиц, использование активированной путем замораживания биомассы дрожжей во всех слу- чаях приводит к ускорению фермента5 тивного превращения фумаровой кислоты в яблочную по сравнению с использованием неактивированных таким способом дрожжей при прочих одинаковых условиях,

10 Наиболее оптимальньй режим работы в диапазоне 34,8-1112 г фумаровой кислоты (субстрата) на 1 г сухой биомассы дрожжей. Ниже 34,8 г фумаровой кислоты в инкубационной сре15 де проводить процесс нецелесообразно из-за низкого абсолютного выхода яблочной кислоты. Верхний предел оп- тимального содержания фумаровой кислоты в инкубационной смеси 20 1112 г на Г г сухой биомассы дрожжей Saccharomyces vini.

При увеличении количества субстрата выше этого значения эффективность превращения фумаровой кисло25 ты в яблочную при использовании активированных дрожжей понижается «, (табл,2, вариант 7),

Для более эффективного превращения фумаровой кислоты в яблочную

30 активированные дрожжи иммобилизуют.

5 1ммобилизацию дрожжей осуществляют путем помещения их в камеру, выпол- неннзпо из полупроницаемой мембраны, например в герметичный целлофановый

35 мешок или трубку. Превращение фумаровой кислоты в яблочную происходит эффективнее, если дрожжи в целлофановом мешочке или трубке погружать в верхние слои раствора фума40 ровой кислоты (табл,4).

Как видно из таблицы, при нахождении иммобилизованных дрожжей в верхних слоях раствора фумаровой кислоты скорость реакции намного

45 выше. Это объясняется тем, что образующаяся яблочная кислота пареме- щается в нижние слои инкубационной смеси из-за большей удельной массы по сравнению с фумаровой кислотой.

При иммобилизации дрожжей Sacch. cerevisiae pfin их стабилизирования в камеру из полупройацаеМой мембра- ,ны вводят гемоглобин в количестве 3-20 мае,% или суспензию эритроци- тов в количестве 7-450 об.% от объема содержимого камеры (табл.5 и 6). Суспензию эритроцитов получают центрифугированием крови быка с после-

.,

дующим промьшанием 0,9%-ным раствором хлористого натрия.

Из табл.5 видно, что при увеличении количества гемоглобина в целлофановом мешочке с хлебопекарными дрожжами, катализирующими превращение фумаровой кислоты в яблочную в последовательных циклах, увеличивается число циклов, осуществляющих 80%-ное превращение, уменьшается время их завершения, а также возрастает число последовательных циклов с сохранением каталитической активности дрожжей, наблюдавшейся в первом и втором циклах. Минимальное число циклов, в которых имеет место 80%-ное превращение фумаровой кислоты в яблочную, наблюдается в отсутствие гемоглобина. Все это свидетельствует о стабилизирующем действии гемоглобина на фумаразную активность иммобилизованных хлебопекарных дрожжей.

Из табл.6 видно, что аналогичное стабилизирующее действие на фумаразную активность иммобилизованных хлебопекарных дрожжей- при их функционировании в. последовательней циклах оказывают добавки суспензии эритроцитов быка. Целесообразно вводить 7- 450 об.% суспензии эритроцитов от объема содержимого камеры. Более низкие концентрации оказывают понижен- ньм стабилизирующий эффект. Вводить количества суспензии эритроцитов больше 450 об.% нецелесообразно, так как уже это количество занимает почти весь целлофановый мешочек.

Пример 1.1г влажной биомассы Candida lipolytica, выращенной на среде с и-алканами, отсепариро- ванной и промытой водой, замораживают до (-5)-(-9)С и вьщсрживают в замороженном состоянии в течение 7 сут. Затем дрожжи смешивают с 800 мл 1,5 М раствора фумарата аммония, содержащего 180 г соли (рН 7,9) до образования гомогенной суспензии. Полученную суспензию, содержащую 558 г фумаровой кислоты в расчете на 1 г сухой биомассы С. lipolytica, выдержирзют при комнатной температуре (18-25-С). Превращение фумаровой кислоты в яблочную контролируют методом тонкослойной хроматографии . на пластинках Силуфол в системе этанол : концентрированный раствор аммиака (8,5:1,5 по объему). Прояв5

540044

ление пластин после высзтаивания при. осуществляют после обработки 0,1%-ным водно-спиртовьм раствором бромфенола синего.

5 О количестве образующейся яблочной кислоты и уменьшении количества фумаровой кислоты судят путем сравнения интенсивности пятен с контрольными (наносимыми на пла:стинку разtO ными количествами яблочной и фумаровой кислот). На стартовую линию хро- матограммы наносится также некоторое количество янтарной кислоты, что позволяет судить о ее наличии в инкуба 5 ционной смеси.

В табл.7 приведены результаты превращения фумаровой кислоты в яб- 1лочную в процессе инкубирования дрожжей С. lipolytica.

20 Из таблицы следует,что за 16 сут в растворе получено 515 г яблочной кислоты в расчете на 1 г сухой биомассы.

После окончания процесса в инкубационную смесь добавляют концентрированную соляную кислоты до рН 1-2. Полученную смесь выдерживают при (+5)-(-ИО) с в течение 16-20 ч, затем отфильтровывают от осадка фума0 ровой кислоты, которую высушивают и оставляют для регенерации. В полученном фильтрате, нагретом до 48- 55°С, при размешивании растворяют 35,6 г растертой гидроокиси каль5 ция. Полученньй раствор охлаждают при размешивании, при этом, начиная примерно с , выпадает белый осадок. Полученную суспензию вадерживают при периодическом перемешивании при

0 ()-(+10)°С в течение 16-20 ч, затем выпавший в осадок кислый яблочно-кислый кальций отфильтровывают и растворяют в 1990 мл воды при и помешивании. {1еобходимое количество

5 гидроокиси кальция для получения

кислого малата кальция и необходимое количество воды для получения 8%-но- го раствора последнего рассчитывают на основании достигнутой степени

0 превращения фумаровой кислоты в яблочную во взятом объеме 1,5 М раствора фумарата аммония).

Раствор кислого малата кальция 5 пропускают через термостатируемую при 55 С колонку с катионитом КРС-10 в водородной форме. Получаемый кислый раствор яблочной кислоты упари ют в вакууме досуха, не допуская нагревания выше .

Выход яблочной кислоты -88,75 г. Пример 2.К суспензии то- верных хлебопекарных дрожжей производственного объединения Друва приготовленной как описано вьше и хранившейся в течение 87 сут при (-5)-(-20)С, добавляют пенопласт в кусочках (примерно 2 2 2 мм) до покрытия всей поверхност-и, все осторожно перемешивают. Освобожденную с помощью пенопласта от толуола суспензию сливают с кусочков пенопласта и центрифугируют. К 0,62 мл полученного после центрифугирования прозрачного экстракта суспензии хлебопекарных дрожжей (что соответствует 0,31 г влажных дрожжей, удельный вес которых приблизительно 1 г/мл) добавляют 0,5 г сухого фумар 1та аммония и 1,3 мл хранившейся при (5)- (-9) € суспензии эритроцитов быка, переносят все в целлофановый мешо- чек, и удаляют из него воздух.

Завязанный целлофановьй мешочек с раствором экстракта суспензия хлебопекарных дрожжей с общей рабочей поверхностью 31 см вьщерживают при комнаткой температуре (18-25°С) в верхних слоях следующих друг за другом порций объемом 58 мл t,5 М фу- марата аммония, содержащих 13 г со- ли°(рН 7,9) до достижения 80-83% превращения фумарата в яблочную кислоту. Прореагировавшие смеси сливают вместе н хранят до выделения Ь-яблочной кислоты при температуре от О до . Контроль за процессом осуществляют по примеру 1. Примеси янтарной кислоты не обнарзшено,

Первый цикл завершен за 10 сут, последующие 6 циклов завершены за 9-10 сут каждый, т.е. в течение 66 сут на протяжении 7 циклов препарат работает с полным сохранением начальной фумаразной активности. Последующие 5 циклов завершены за 15- 17 сут каявдый. Таким образом, до завершения 12-го цикла включительно, т.е. около 5 мес., препарат работает с активностью, превьшакядей 50% начальной . Дальнейшие даклы завершаются за 25-28 сут каждый, ПоЬле завершения 23 циклов (14 мес. работы) получено 1304 мл прореагировавшей ш- кубационной смеси, из которой вьще- лен 131 г яблочной кислоты способом рписанньм в примере 1.

Таким образом, в расчете на 1 г сухой биомассы дрожжей образовано 2700 г .яблочной кислоты.

Пример 3. Из дрожжей Saccha- romyces vini (расса Феодосия), выращенных на среде с мелассой, отсе- парированных, промытых водой и хранящихся при температуре от -5 до -9 с в течение 42 сут, готовят однороднуто суспензию путем смешивания 0,1 г прессо/занной биомассы с 1 мл 1,5 М фумарата аммония, содержащим 0,225 г соли (рН 7,9). К 0,2 мл полученной суспензии, содержащей 0,02 г

влажных дрожжей, добавляют 346 мл 1,5 М фумарата аммония (0,78 г) переносят в целлофановый мешочек, из которого удаляют воздух. Завязанный мешочек с суспензией дрожжей общей

рабочей поверхностью около 31 см вьщерживают при комнатной температуре (18-25 С) в верхних слоях следующих друг за другом порций объемом 60 мл 1,5 М фумарата аммония, содержащим 13,5 г соли (рН 7,9), до дос- тижения 80-95% превращения фумаратаа в яблочную кислоту. Прореагировавшие реакционные смеси собирают и хранят при температуре от О до +5°С до выделения яблочной кислоты, которое осуществляют по примеру 1.

Первый цикл завершен за 20 сут, последую цие 5 циклов завершены за 20-22 сут каждый, седьмой цикл завершен за 19 суток. Таким образом, в течение 143 сут на протяжении 7 последовательных циклов препарат иммобилизованных дрожжей работает с полньм сохранением исходной фумаразной активности. На этой стадии полу- чено 416 мл прореагировавшей реакционной смеси, из которой выделено 56,4 г яблочной кислоты способом, описанным в примере 1. Таким образом, в расчете на 1 г сухой биомассы дрож

зкей получают 1 3400 г я ал очной кислоты.

Пример 4. 50 г хлебопекарных дрожжей производственного объединения Друва смешивают с 50 мл раствора, содержащего 1,75 г калия фосфорнокислого двухзамещенного, 0,2 г сульфата магния и 1 г фумаро- Бой кислоты (рН 7,2-7,4). При необходимости рН доводят до требуемого значения с помощью КОН.

Полученр. ую суспензию выдерживают при 28-30 С и встряхивают в течение 18-22 ч. Затем к ней добавляют 10 мл

толуола и продолжают встряхивать при в течение l-t,2 ч. Обработанную толуолом суспензию вьщержи- вают 30 сут при температуре от -5 до -20°С. Затем к ней добавляют кусочки пенопласта ( мм) до покрытия всей поверхности и осторожно перемешивают . Освобожденную таким способом от толуола суспензио дрожжей сливают с кусочков пенопласта и центрифуги- руют,

К 2 мл полученного после центрифугирования прозрачного экстракта суспензии хлебопекарных дрожжей,что соответствует 1 г влажных дрожжей, добавляют 50 мл 1,5 М раствора фума- рата аммония, содержащее И,25 г соли (рН 7,9). При таком соотношении на I г сухой биомассы дрожжей приходится 34,8 г фумаровой кислоты.

Ckecb инкубируют при 40°С, Через сутки 85% фумаровой кислоты превращается в яблочную, что соответствует образованию 34,2 г яблочной кислоты на 1 г сухой биомассы дрожжей.

При использовании хлебопекарных дрожжей, не подвергнутых активированию, при прочих одинаковых условиях 85%-ное превращение фумаровой кислоты в яблочную наблюдается только через 3 сут.

Контроль за процессом и вьщеление яблочной кислоты осуществляют по примеру 1.

Пример 5. Из дрожжей Saccha romyces vini (расса Феодосия), выращенных на среде с мелассой, отсе- парированных, промытых водой и выдержанных при -(5)-(-9)С в течение 17 сут, готовят однородную суспен- зию путем смешивания 1 г прессованной биомассы с 1600 мл t,5 М раствора фумарат,а аммония, содержащего 360 г соли (рН 7,9), что соответствует 1112 г фумаровой кислоты на 1 г сухой биомассы дрожжей.

Инкубирование осуществляют при комнатной температуре, через 11 сут 80% фумаровой кислоты превращается в яблочную. Выход яблочной кислоты составляет t028 г на 1 г сухой биомассы дрожжей.

При применении дрожжей, хранившихся при температуре от О до +5°С в течение 8 сут, т.е. е подвергну- тых активированию путем зш оражива- ния, при прочих одинаковых условиях за этот же период време только 30%

Фз маровой кислоты превращено в яблочную.

Контроль за процессом и вьщеление яблочной кислоты осуществляют по примеру 1 .

Пример 6. 0,1 г влажной биомассы хлебопекарных дрожжей, хранившихся при температуре от -5 до -9 °С в течение 145 сут, помещают в целлофановый мешочек, в который добавляют 0,84 мл 1,5 М раствора фумарата аммония, содержащего О,19 г соли (рН 8,2), 0,01 г фумарата аммония и Oj063 мл суспензии эритроцитов быка, что составляет приблизительно

7об.% от объема содержимого камеры. Целлофановый мешочек с рабочей поверхностью 9,9 см, из которого предварительно удален воздух, завязывают и помещают в 1,5 М раствор фумарата аммония (рН 8,2) объемом

14 мл, что соответствует содержанию 3,15 г соли.

За протеканием процесса следят по примеру 1. После превращения 8U- 90% фумаровой кислоты в яблочную целлофановый мешочек переносят в новую порцию фумаровой кислоты.

Результаты представлены в табл.6.

Как видно из таблицы, добавление суспензии эритроцитов быка оказывает заметное стабилизирующее действие.

8циклах 1-4 не менее 80% превращения фумаровой кислоты в яблочную происходит в течение 7-11 суток, а

в последующих циклах - в течение 21- 22 сут.

Без добавления суспензии эритроцитов уже во втором цикле в течение 10-21 суток достигнуто только 40% превращения фумаровой кислоты в яблочную.

Пример 7. 0,1 г влажной биомассы хлебопекарных дрожжей, хранившихся при температуре от -5 до в течение 145 сут, помещают в целлофановый мешочек, в который добавляют 0,2 г сухого фумарата аммония и 0,9 мл суспензии эритроцитов быка, что составляет 450 об.% от объема содержимого камеры. Целлофановый мешочек, из которого предварительно удаляют воздух, завязывают и помещают в 1,5 М раствор фумарата аммония (рН 8,2) объемом 14 мл, что соответствует содержанию 3,15 г соли.

За процессом следят по примеру 1.

После превращения 80 90Z фумаро- йой кислоты в яблочную целлофановый мешочек переносят в новую порцию раствора фумарата аммония. Результаты представлены в табл.6.

Как видно из таблицы, длитель- иость превращеняя основного количества фумаровой кислоты s яблочную в первых двух 1щклах составляет 7 сут, в следующих трех циклах- сут.,

Влияние активирования дрожжей на превращение фумаровой

кислоты в яблочную

17,4 69,6

Таблиц а 2

Влияние активирования дрожжей Saccharomyces vini на гфевращение фумаровой кислоты в яблочную

Биомасса не заморожена

17,4

То же

557,0

Реализация предлагаемого изобретения позволяет значительно увеличить скорость по. .учения L-яблочной кислоты и выход продукта в расчете

на 1 г биомассы дрожжей, упростить процесс при использовании дрожжей, иммобилизованньк предложен- :шм способом, а также снизить затраты на получение целевого

продукта.

Таблица 1

7 8

17,45 68,3

За t9 сут в яблочную кислоту превращено около 5% фумаррвой

16,8

14

514,6

2224,0

-ТаблицаЗ

Влияние активировайия дрояскей Saccharomyces cerevisiae на превращение фумаровой кислоты в яблочную

Вномасса Кб заморожена

Биомасса заморожена

То же

(Другой образец)

За 24 сут в яблочную кислоту превращается не более 70% фума- ровой кислоты

1

2 2

34,2

34,2 16,1 32,2

13

Влвияние положения полупроницаемой камеры с дрожл ами в инкубационной среде на превращение фумаровой кислоты в яблочкую

1

2

6 6

54

37

414

515

Таблица 5

Влияние гемоглобина на превращение фумаровой кислоты в яблочную иммобилизованнымн дрож- Saccharomyces cerevisiae

Время (сут), 33 течение которого в каждом цикле не менее 80% фумаровой кислоты превращается в яблочную, зз зависимости or количества

Фжл

гемоглобина в полупроницаемой камере с дрожжами.

0

10

Цикл

14 Продолжение табл.5

Время (сут) в течение ко- i торого в каждом цикле не менее 80% фумаровой кислоты превращается в яблочную, в зависимости от количества гемоглобина в полупроницаемой камера с дрожжами, мае.%.

Е1П1Г

10

20

7 8

10

11римечание, В цикле 3 через 22-31 сут достигнуто лишь 60% превращения фумаровой кислоты в яб- лочную; в цикле 4 через 1О-17 сут достигнуто лишь 70% превращения фумаровой кислоты в .яблочную; в цикле 6 через 21-28 сут достигнуто лишь 20% превращения фумаровой кислоты в яблочную; в цикле 7 через 10- 16 сут достигнуто лишь 40% превращения фзт аровой кислоты в яблочную; в цикле 10 через 6-9 сут достигнуто лишь 40% превращения фумаровой кислоты в яблочн5то.

Таблица 6,

Влияние суспензии эритроцитов на превращение фумаровой кислоты в яблочную иммобилизованными дрожжами Saccharomyces cerevisiae

10 10 12

Продолжение табл. 6

сут) в течение ко- торого в кеакдом цикле не менее sot фумаровой кислоты превращается в яблочную, в зависимости от количества суспензии эритрощггов в полупроницаемой камере с дрожжами, об.Х

ГнТззТюо

Примечание. В цикле 2 через 10-21 сут достигнуто лишь 40% превращения, фумаровой кислоты в яблочную, в цикле 7 через 21 сут достигнуто лишь 70% превращения фумаровой кислоты в яблочную, в цикле 6 через 14-15 сут достигнуто лишь 70% превращения фумаровой кислоты в яблочную, в цикле 7 через 14-15 сут достигнуто лишь 70% превращения фумаровой кислоты в яблочную, в цикле 8 через 13-15 сут достигнуто лишь 65% превращения фумаровой кислоты в яблочную.

Редактор Л. Повхан

Составитель Л. Минаева

Техред М.Ходанич Корректор А. Обручар

4687/29

Тираж 490 Подписное ВНИИПИ Государственного ксмитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

14 оизводственно-полиграфнческое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная,4

Превращение фумаровой кислоты в яблочную свободными дрожжами Candida lipolytica

to

450

3

14 16 20

10 30 70 80 80

Нет Нет

30