Штамм бактерий СIтRовастеR FReUNDII для биотрансформации фумарата в L-яблочную кислоту Советский патент 1989 года по МПК C12N1/20 C12N9/88 C12P7/46 

Изобретение относится к биотехнологии, к производству органических кислот микробиологическим способом и может быть применено в микробиологической, медицинской, пищевой промышленности, в парфюмерии и металлур-г гии (в качестве комплексообразователя, при извлечении некоторых метал- лов).;

Цель изобретения - штамм бактерий рода Citrobacter freundii (штамм ЗГ), обладающий высокой синтезирующей активностью, стабильностью биосинтеза, независя1чей от возраста культуры, более высокой степенью конверсии субстрата в L-яблочную кислоту, что позволяет повысить выход целевого продукта.

Штамм Citrobacter freundii ЗГ получен из природных субстратов (огородные почвы) в результате селекции на среде с формиатом и депонирован в коллекции промышленных микроорганизмов ВНИИГенетика и имеет регистраци- . онный номер В-4090.

Штамм Citrobacter freundii ВКПН № 8-4090 характеризуется следующими признаками.

Морфологические и физиологические признаки.

Клетки бактерий представляют собой грамотрицательные подвижные перитриСЛ1Гч5 СО СП

О5

СО

хиальные палочки с закругленными концами 0,4-0,5 X 1-2 им, капсул и спор не образуют. Факультативные анаэробы. Оптимальный рост наблюдается при ZS-SO C. Односуточные колонии на мясо-пептонном агаре (МПА) круглые, блестящие, прозрачные, однотипные, с ровными краями, диаметром 1-2 мм, позднее - серовато-белые, блестящие. При росте на твердых средах вокруг колоний на сут, появляются концентрические йруги в, виде швермеров.

Рост на мясо-пептонном бульоне (МПБ) обильный, в виде муТи,. с сероватым оттенком, пленки не образует, в старых культурах муть, осадок. В 2 -часовых культурах образование индола не наблюдается. Сероводород образует.

Штамм растет на жидкой среде из 21-ного муравьинокислого кальция и 0, пептона. При этом дает муть по всей пробирке, образует газ и плотную пленку мела на поверхности среды за счет разложения муравьиной кислоты.

При росте на молоке происходит подкисление и коагуляция. Рост на картофельном агаре в виде серовато- белого налета. Культура обладает характерным запахом. Желатину не разжижает.

Отношение к углеводам. Разлагает с образованием кислоты и газа глюкозу , фруктоау, галактозу, арабинозу, маннит, ксилозу, крахмал. Лактозу сбраживает медленно. Не растет на Сахарозе, декстрине, дульците, инозите. Испол ьзует в качестве источника углерода пируват, формиат, фумарат, глицерин. KNC рост не ингибирует. Ма- лонат не использует, может расти на средах, содержащих в качестве единственного источника углерода 1% .лимонной кислоты.

Отношение к азотистым веществам. Хорошо растет за счет аммонийного и аминного азота, пептона. Нитраты восстанавливает до нитритов. Обладает каталазной активностью.

Штамм хорошо растет на лабораторных средах. Не испытывает потребности в факторах роста. Выращивание бактерий длится от 9 до 36 ч, лучше 12- 18 ч, при значениях величинь) рН 6,8- 8,0 (лучше при 7,0-7,2) и температур 20-37 0 (лучше при 25-30°С).

5

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

Условия хранения штамма на твердых средах (МПА) под слоем стерильного вазелинового масла или в лиофйлизо- ванном состоянии.

П р 1 м е р 1. Односуточные клетки бактерий С.freundiiBKHM № смывают с поверхности МПА 1-2 мл жидкой стерильной водопроводной воды и с помощью стерильной пипетки переносят в стерильную посевную жидкую среду того же состава (МПБ), начальное значение величины рН которой равно 7,0-7,2. Культуру выращивают 10-12 ч при йЗ-ЗО С в качалочных колбах емкостью 750 мл (объем среды 50 мл). Затем посевной материал в количестве 2-3 вносят в среду того же состава и выращивают в течение ч тем же способом, в аналогичных качалочных колбах с объемом среды 125 мл. Клетки отделяют от среды центрифугированием при 8000 об./мин в течение 10 мин.

Биомассу суспендируют в 0,01 М фосфатном буфере (р.Н 7,3) из расчета 6-16 мг белка клеток бактерий в 1 мл суспензии. Определение фумарат-гидра- тазной активности клеток бактерий проводят известным способом по .количеству образовавшейся L-яблочной кис-i лоты из фумарата калия. Реакцию синтеза молочной кислоты проводят в течение 1 ч при на качалке при 175 об./мин.

Удельная активность фумаразы 9 часовых клеток бактерий C.freundii 3 г равна 2,6 1U MM яблочной кислоты на мг белка за 1 с, что соответствует 97,9 от потребленного фумарата; у клеток 24-часовой культуры 3,1 яблочной кислоты (99,2 от потребленного фумарата); у 48-часовой культу- . ры - 3, яблочной кислоты (98,9 от потребленного фумарата) и у 72-часовых клеток 2, , что соответствует 98,3 превращению фумарата в малат.

Результаты сравнения фумаратной активности штамма с известным штаммом Paracolobacter aerogenoides f 14 При инкубации целых клеток бактерий с фумаратом- калия в течение 1 ч представлены в таблице.

П р и м е р 2. Выращивание биомассы клеток бактерий C.freundii ВКПМ № В-4090 проводят, как описано в мере 1 в течение 12-14 ч.

Реакционная Смесь для синтеза яблочной кислоты содержит в 1 мл

1,65 мг: белка клеток, либо 3,3 мг белка, либо ,95 мг белка клеток бактерий., Опред еление фумарат-гидратаз- Ной активности проводят известным способом. Потребление фумарата от его исходного количества в реакционной смеси составляет соответственно 52,8, 76,8 либо 79,21 с глубиной превращения потребленного фумарата в яблочную кислоту5равной соответственно 87,2 либо 95,3, либо 99,2.

Удельная активность фумаразы клеток C.freundii ВКПМ № в зави1523369

в стерильную синтетическую среду со значением величины рН 7,2, приготовленную на дистиллированной воде,следующего состава, %: NayEP04 1,

5 0,15; (mg,S04 0,2; MgSO,. х7Н20 0,02 CaCl2 6H O 0,01; FeS04 0,00005; , Zn+2 следы; глюкоза либо глицерин 1,0. Культуру

Q выращивают 2 ч при 28-30°С в кача- лочных-колбах емкостью 750 мл с объе мом среды 0 мл. Затем посевной материал R количестве 3-5 вносят в

стерильную.жидкую среду того же сос- симости от количества белка, содержа- 5 тава в аналогичные качалочные колбы щегося в 1 мл реакционной смеси,соот- с объемом среды 125 мл и выращивают ветственно равна либо 5,1-10, либо 3,7-10, либо 2,6-10- мИ на 1 мг белка за 1 с.

при той же температуре в течение 30- 48ч.

Клетки отделяют от среды центрифу

П р и м е р 3. Односуточные клетки 20 гированием при 8000 об,/мин в течение

30

C.freundii ВКПМ № B- j090 смывают с поверхности агаризованной (1,5 агара) среды из ферментолизата биомассы микроорганизмов, выросших на углеводородах (3% ферментолизата БВК в во- 25 допроводной воде) 1-2 мл жидкой питательной среды того же состава и с помощью стерильной пипетки переносят в жидкую посев ную среду того же состава (начальное значение рН 7,2). Культуру выращивают 10-12 ч при 28- 30°С в качаломных колбаХ емкостью 750 мл с объемом среды 50 мл. Затем посевной материал в количестве 2-3% вносят в среду того же состава и выращивают культуру 12-16 ч тем же способом в аналогичных качалочных колбах с объемом среды 125 мл. Клетки отделяют от среды центрифугированием при 8000 об,/мин в течение 10 мин. ,

Биомассу суспендируют в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,5 (6-20 мг белка клеток бактерий в 1 мл суспензии) и определяют активность фумарат- гидратазы известным методом.

Удельная активность фумаразы 12- часовых клеток бактерий C.freundii, выросших на среде в 3% ферментолизата BBKjpaBHa 2,4 яблочной кислоты на 1 мг белка клеток бактерий за 1 с, что соответствует 99%-ному превращению потребленного фумарата.

П р и м е р 4. Односуточные клетки бактерий C.freundii ВКПМ N В-4090 смывают с поверхности агаризованной (1,5 агара) среды МПА 1-2 мл стерильной водопроводной воды и с помощью стерильной пипетки переносят

10 мин, затем биомассу суспендируют в 0,01 М фосфатном буфере при рН 7,5 из расчета 10-20 мг белка клеток бактерий и определяют активность фумарат- гидротазы известным методом.

Удельная активность фумаразы клеток бактерий C.freundii ВКПМ В-4090, выросших на синтетической среде с глюкозой либо с глицерином,соответственно равна 2,910 и 2,1 яблочной кислоты на 1 мг клеток бактерий за 1 с.

П р и м е р 5. Выращивание биомассы бактерий C.freundii ВКПН Г В-4090- проводят либо на МПБ, как описано в примере 1 , либо на среде с 3% ферментолизата БВК, как описано в примере 3. ,

Исходная удельная фумарат-гидратаз ная активность клеток бактерий C.freundii, выросших на среде с МПБ, равнялась 8, на среде с ферментоли- затом БВК 5,7-10 мГ с .

Часть объема суспензии клеток бактерий хранят в течение 7 сут при (-4) - (6)°С в фосфатном буфере. По истечении указанного времени удельная активность фумаразы клеток бактерий, выросших на МПБ, составляет, 82,7%, а на среде с ферментолизатом БВК б1,4 от исходной удельной активности клеток бактерий.

Другую пблоаину объема суспензии клеток бактерий C.freundii хранят в течение 7 сут, при (-4) - (6) С в растворе фумарата. По истечении указанного времени удельная ферментативная активность клеток, выросших на МПБ, составляет 108,6, а на среде с фер40

55

акз-нот1523369

в стерильную синтетическую среду со значением величины рН 7,2, приготовленную на дистиллированной воде,следующего состава, %: NayEP04 1,

0,15; (mg,S04 0,2; MgSO,. х7Н20 0,02 CaCl2 6H O 0,01; FeS04 0,00005; , Zn+2 следы; глюкоза либо глицерин 1,0. Культуру

выращивают 2 ч при 28-30°С в кача- лочных-колбах емкостью 750 мл с объемом среды 0 мл. Затем посевной материал R количестве 3-5 вносят в

стерильную.жидкую среду того же сос- тава в аналогичные качалочные колбы с объемом среды 125 мл и выращивают

при той же температуре в течение 30- 48ч.

Клетки отделяют от среды центрифу0

5

10 мин, затем биомассу суспендируют в 0,01 М фосфатном буфере при рН 7,5 из расчета 10-20 мг белка клеток бактерий и определяют активность фумарат- гидротазы известным методом.

Удельная активность фумаразы клеток бактерий C.freundii ВКПМ В-4090, выросших на синтетической среде с глюкозой либо с глицерином,соответственно равна 2,910 и 2,1 яблочной кислоты на 1 мг клеток бактерий за 1 с.

П р и м е р 5. Выращивание биомассы бактерий C.freundii ВКПН Г В-4090- проводят либо на МПБ, как описано в примере 1 , либо на среде с 3% ферментолизата БВК, как описано в примере 3. ,

Исходная удельная фумарат-гидратаз- ная активность клеток бактерий C.freundii, выросших на среде с МПБ, равнялась 8, на среде с ферментоли- затом БВК 5,7-10 мГ с .

Часть объема суспензии клеток бактерий хранят в течение 7 сут при (-4) - (6)°С в фосфатном буфере. По истечении указанного времени удельная активность фумаразы клеток бактерий, выросших на МПБ, составляет, 82,7%, а на среде с ферментолизатом БВК б1,4 от исходной удельной активности клеток бактерий.

Другую пблоаину объема суспензии клеток бактерий C.freundii хранят в течение 7 сут, при (-4) - (6) С в растворе фумарата. По истечении указанного времени удельная ферментативная активность клеток, выросших на МПБ, составляет 108,6, а на среде с фер0

5

15

ментолизатом БВК 98,0% от исходной удельной активности клеток бактерий.

П р и м е fj 6. Выращивание биомассы бактерий C.freundii ВКПМ М° В- 4090 проводят на МПБ, как описано в примере 1.

Полученную суспензию клеток деля-г пополам и в однрй порции определяют удельную активность фумарат-гидрата- зы, которую принимают за 100%.

Из другой порции суспензии клеток готовят биокатализатор путем иммоби- лизации нативных клеток бактерии C.freundii в каррагинан. Для этого 6 мл физиологического раствора (0,8S% NaCl в дистиллированной воде) помещают в стеклянный химический стакан емкостью 500 мл и добавляют 0,35 г каррагинана. Суспензию каррагинана в физиологическом растворе оставляют на 30-40 мин при комнатной температуре (18-22°С) для набухания. По истечении указанного времени суспензию I нагревают на водяной бане до полного растворения каррагинана (УО-ЭО С). Полученный раствор охлаждают до 5- и Добавляют 1 мл суспензии клеток бактерий, быстро тщательно перемешивают и смесь охлаждают в течение 10 мин на ледяной бане или в морозил ке холодильника. Блок иммобилизованных клеток переносят в стеклянный химический стакан емкостью lOO мл, содержащий 300 мл 0,3 М КС1, и выдерживают в течение 1б ч при комнатной температуре для увеличения жесткости геля. По истечении указанного времен полученный блок геля с иммобилизованными клетками бактерий протирают че- рез сито с диаметром ячеек 1 мл. do- лученные гранулы биокатализатора промывают 2-3 раза 0,05 М Фосфатным буфером с рН 7,5. Определение фумаратгидратазной активности проводят из- вестным методом по потреблению фума- рата и образованию L-яблочной кис- лоты.

Полученный таким образом биоката- пизатор содержал 0,8202 мг белка клеток бактерий в 1 мл реакционной смеси и проявляет активность, равную 180 от исходной.

При иммобилизации в каррагинан количество образования побочного про;

0

569

0 0

8

дукта в виде L-аспарагиновой кислоты составляет от 0-0,3 до 2,1-2,.

Пример 7. Выращивание биомассы бактерий C.freundii ВКПМ № проводят на среде с ферментолизатом БВК, как описано в примере 3.

Полученную суспензию клеток делят пополам и в одной порции суспензии определяют исходную удельную фумараз- ную активность, которую принимают за 100.

Из другой половины суспензии клеток бактерий готовят биокатализатор путем иммобилизации нативных клеток бактерий в-каррагинан, как описано в примере 6,

Полученный таким образом биокатализатор содержит 0,1028 мг белка в 1 мл реакционной смеси и проявляет удельную активность, равную 290% от исходной активности нативных клеток.

Форм у лай 3 обретения Штамм бактерии Citrobacter freun-i dii ВКПМ f В- 4090 для биотрансформа- ции фумарата в L-яблочную кислоту.

0 и 40 , ;

;„зо

0 0

5

5

0

Время инкубации клеток,ч Образование яблочной кислоты, г/л Превращение фумарата в яблочную кислоту, % Скорость трансформации фумарата в яблочную кислоту, г/л-ч- Удельная активность, г яблочной кислоты.- сухой биомассы МИН

60,9

7В

26,0

39

60,9

5,2

5,87

0,21

Изобретение относится к производству органических кислот микробиологическим способом и может быть использовано в микробиологической, медицинской и пищевой отраслях промышленности, в парфюмерии и металлургии / в качестве комплексообразователя при извлечении некоторых металлов/. Целью изобретения является штамм бактерий CITROBACTER FREUNDII ВКПМNВ-4090, обладающий высокой синтезирующей активностью, стабильностью биосинтеза, более высокой степенью конверсии субстрата в L -яблочную кислоту, что позволит повысить выход целевого продукта. Штамм обладает высоким, относительно стабильным уровнем фумарат - гидратазы, активность которой мало зависит от возраста и условий выращивания культуры. Это позволяет получать более 99% целевого продукта от потребленного количества субстрата. За счет роста предлагаемого штамма бактерий на среде с 3% ферментолизата БВК и последующей иммобилизации нативных клеток бактерий в каррагинан выход целевого продукта повышается. 1 табл.