Способ подготовки биологических препаратов к микроскопическим исследованиям Советский патент 1986 года по МПК G01N33/50 G01N1/38 

1

Изобретение относится к медицине, а именно к способам подготовки и микроскопическим исследованиям биологических препаратов.

Целью изобретения является исклга- 4etrae артефактов препарирования при .использовании криопротекторов нпдро- кого спектра действия.

Способ осуществляется следующим образом.

При подготовке биологических объектов к микроскопическим исследованиям,, осуществляющей их фикса- цию в растворе глутарового альдегида, отмывкуJ постфиксацшо раствором осмиевой кислоты, обезвоживание к заключение в смолы, причем, фиксацию осуществляют раствором глутарового альдегщ1,а, содержащим исследуемое вещество в концентрации,равной его концентрации в фиксируемом объекте, затем производят О тмывку в ряду растворов исследуемого вещества на фосфатном буфере, концентра- UH, которого ступенчато уменьшают до 0.

Пример 1. Эритроциты крови инкубируемые, с раствором пропиленгликоля, охлаждалн до центрифугировали при 3000 об/мин в течение .5 мин, сливали надосадок и центрифугат заливали пятикратным объемом фиксирующего 4%-ного раствора - глутарового альдегида на 0,1 М фосфатом буфере, содержащем 40% про пнленгликоля, рН 7,3; 300 мосмоль/кг

по буферу. 1(летки суспендировали в растворе перемешиванием и фиксировали 3 течение 1 ч, затем отмывали в ряду растворов пропиленгхдаколя н а 0,1 М фосфатном буфере, нисходящей концентрации от 40 до 0% при из менении концентрации в каж,цом последующем растворе на 10%, Эритроциты, переведенные таким образом в чистый фосфатный буфер, обезвржива- ,гта в ряду растворов ацетона восходщей концентрации (50, 75 и 100%), посла чего суспензию наносили .на предметный столик, подсултнали и на гошяли в вакууме серебром, Подготов ленный препарат исследовали в растровом электронном микроскопе.

После обработки предлагаемым спо .собом изменени.я объема н .формы по данньм светоиптп гескай микроскопии не отмечалось. В растровом электрон ном микроскопе эритроциты имели

5Д34А2

форму ииповидного эллипсоида, что . соответствовало предлагаемой реакции эритроцитов на действие высокой концентрации пропиленгликоля.

5 Пример 2. Эритроциты крови человека, инкубируемые с 60%-ным раствором пропиленгликоля, охлаждали до , центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 мин, сливали

SO надосадок и центрифугат заливали пятикратным объемом фиксирующего 4%-ного раствора глутарового альдегида на 0,1 М фосфатом буфере, содержащем 60% пропиленгликоля,

5 имеющем рН 7,3 и 300 мосмоль/кг по буферу, клетки суспендировали в растворе перемешиванием ,и фиксирова-. ли в течение 1 ч, затем отмывали в ряду растворов пропиленгликоля на .20 0,1 М фосфатном буфере нисходящей концентрации (60, 50, 40, 30, 20, 10 и 0%). Эритроциты, переведенные в чистый фосфатный буфер, обезвоживали в ряду растворов ацетона 50, 75

25 и 100%, после чего суспензию наносили на предметный столик, подсушивали и напы.пяли в вакууме серебром, Подготовленньщ препарат исследовали в растровом электронном микроскопе.

30 После обработки предлагаемым способ.ом нзненений объема и формь эритроцитов по данным сватооптичес- кой микроскопии не отмечалось. В растровом электронном м.икроскопе g эритроциты форму шицоввдного

эллипсоида со складчатой поверхностью мембран отдельных клеток,

П р .и М е р 3. Клетки костного мозга, инкубируемые с раст 0 вором полиэтиленоксида молекулярной массы 400 (ПЭО-400) охлаяэдали до 0±4°С, центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 мин, сливали надосадок и центрифугат заливали пятикратным

45 объемом фиксирующего раствора 4%-ным глутаровым альдегидом на 0,.1 М фосфатном буфере, содержащем 15%-кый раствор ПЭО-400, РН 7,3, 300 мосмоль/кг по буферу, клетки

5Q суспендировали в растворе перемешиванием и фиксировали в течение 1 ч, затем отмывали в ряду растворов ПЭО-400 на 0,1 М фосфатном буфере нисходящей концентрации: 15, 10, 5 .

jj и 0%. Отмытые клатки постфиксировали в 1%-ном растворе осмиевой кислоты, обеавоживали в ряду растворов ацетона восходящей концентрации (50, 75,

100%) и заключали в эпонаралдитовую смесь,

После обработки клеток предлагаемым способом более 90% срезов клеток имели состояние, близкое к на- тивному. Срезы клеток, претерпевшие изменения, имели, в основном, частично просветленный цитозоль,незначительно набухшие каналы эндоплазма- тической сети. Единичные клетки имели сильно набухйие органеллы и каналы эндоплазматической сети, расширенное перинуклеарное пространство, но их количество не отличалось от исходного состояния.

Пример 4. Ткань, щитовщцной железы и гипофиз крысы инкубировали 30 мин с 15%-ным раствором ДМСО при комнатной температуре. После инкубации фиксировали 2,5Д-ным глютаральдегидом на фосфатном буфере, содержащем 15% ДМСО. Дальнейшую подготовку образцов осуществляли в соответствии с прописями использованных способов. Исследования, проведенные на ульт ратонких срезах в

электронной микросхеме ЭВМ-100БВ, показали, что изменение ультрастэук30

35

туры состояли в набухании митохондрий и лизoco f и в вакуолеобразном расширении эндоппазматической сети, выраженность которых была незначительной,

П р и м е-р 5. Спермии карпа инкубируют 15 мин в 15%-ном растворе ДМСО, после инкубации суспензию центрифугировали, снимали надосадок и фиксировали центрнфугат 2,5%-ным глютаральдегидом на фосфатном буфе- 40 ре, содержащем 15% ДМСО, фиксатор добавляли к центрифугату в пятикратном объеме и вьщерживали 1 ч при +4°С. Исследования в светооптическом микроскопе показали наличие лишь 45 «щиничных клеток в поле зрения (конРедактор А. Гулько

Составитель А. Лычкова

Техред М.Моргентал Корректор А. Обручар

Заказ 4712/46 Тираж 778Подписное

ВНИШ1И Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная,4

центрация клеток в 1 мл суспензии около 4 10 ) с разрушенными нами, значительная часть клеток (больше половины в поле зрения) выглядели интактными меньшая часть - слабонабухшими.

Предложенный способ позволяет устранить артефакты препарирования биологических препаратов в результате контакта с различными веществами в произвольной концентрации и сохранить морфологические параметры неизменными в течение всего процесса подготовки. Это подтверляают данные таблицы, в которой представлен средний объем митохондрий.

Исходное состояние

После инкубации с криопротектором по способу

25

Прототип

Предлагаемый

О,Otto,004

0,00+0,005 0,05t.0,004 Р 0,05 .

30

Формула изобретения

Способ подготовки биологических гфепаратов к микроскопическим исследованиям путем их фиксации в глута- ровом альдеггще с добавлением компенсирующего осмотическое давление вещества, отличающийся тем, что, с целью исключения артефактов препарирования при исполь- - зовании криопротекторов широкого спектра действия, при фиксации к глутаровому альдегиду добавляют в качестве компенсирующего вещества криопротектор в концентрации, равной исходной.

Изобретение относится к способам подготовки биологических препаратов к микроскопическим исследованиям. Цель изобретения - исключение артефактов препарирования при использовании криоцротекторов широкого спектра действия за счет добавления при фиксации к глутаровому альдегиду криопротектора в концентрации, равной исходной. Эритроциты крови инкубируют с 40%-ным раствором пропилен гликоля . Охлаждают, центрифугируют. Центрифугат заливают 4%-ным раствором гяутарового альдегида на 0,1 М фосфатном буфере, содержащем 40%-ный пропиленгликоль. Клетки перемешивают и фиксируют. Затем вают в ряду растворов пропиленгликоля на фосфатном буфере. Эритроциты обезвоживают. Суспензию наносят на предметный столик, подс-ушивают, напыляют в вакууме серебром. Подготовленный препарат исследуют под микроскопом, t табл. т го со . 4: