СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ КЛЕТОК КРОВИ ДЛЯ ИХ ВИЗУАЛИЗАЦИИ ПРИ ПОМОЩИ ИНТЕРФЕРЕНЦИОННОГО МИКРОСКОПА Российский патент 1999 года по МПК G01N1/28 

Изобретение относится к медицине, в частности к диагностике заболеваний системы крови при помощи компьютерного микротомографа.

Новейшее развитие микротехники приводит к поиску новых методов исследования клеток и тканей, таких как исследование в темном поле, применение методов флуоресцентной микроскопии, витальные окраски, культура тканей и т.д. Однако надо признать, что фиксированный препарат по прежнему является основным объектом, так как ни один другой метод не дает такой четкости структур, не позволяет так детально проанализировать морфологию клеток и тканей.

В настоящее время актуальны поиски простых и надежных методов приготовления светооптических препаратов для экспресс- диагностики. Сопоставление результатов световой микроскопии и данных электронной микроскопии, полученных одновременно сходными препаративными методами, обеспечивает более адекватную и уверенную трактовку данных. Кроме того, дополняя друг друга, результаты оказываются, как правило, кореллятивными.

Во многих случаях микроскопического изучения препаратов - клеток и тканей - возникает необходимость приготовления "постоянных" препаратов, позволяющих сохранить изучаемый объект в неизменном (интактном) состоянии в течение длительного времени. В настоящее время применяются несколько способов обработки клеток крови, а именно: заключение в канадский бальзам, в агар, в глицерин-агаровую среду и др. (1). Прототипом предлагаемого нами способа является способ (2). Он заключается в том, что фиксированные, окрашенные и обезвоженные ткани (клетки) заключались в тонкий слой канадского бальзама, пропитавшего объект, между предметным и покровным стеклами. Фиксированные, обезвоженные, но не окрашенные препараты можно изучать лишь применяя эффект "фазового контраста". Дегидратация объекта - непременное условие заключения его в канадский бальзам, растворяемый ксилолом (2). В качестве дегидрататора в последние годы мы успешно применяли ацетон, не препятствующий равномерной пропитке биопрепаратов бальзамом (3). Полная полимеризация канадского бальзама, образующего с биопрепаратом однородный, прозрачный для света слой, заканчивается ко вторым-третьим суткам, после чего объект можно изучать с помощью иммерсионных объективов.

Этот метод отличается от остальных тем, что клетки крови четко зафиксированы (клетки не "плывут" под объективом), а также тем, что из всех вышеперечисленных способов при данном приготовлении препарат является наиболее долговечным.

К недостаткам данного метода относится длительность приготовления препарата, а также не значительная разница между значениями коэффициентов преломления клеток крови и канадского бальзама. Кроме того, после пропитывания клеток крови канадским бальзамом нельзя утверждать о неизменности их цитоархитектоники, что затрудняет интерпретацию полученных в ходе наших исследований результатов. Тем самым исключается возможность определения истинных значений показателя преломления клеток крови.

Предлагаемый нами метод включает в себя данные (см. таблицу).

Подготовка препарата для исследования.

Для исследования эритроцитов использовали цельную кровь. Исследование ядросодержащих клеток проводили, выделяя их в градиенте плотности по Boyum А. (1968).

Фиксация материала. Изучаемые клетки помещали в 2,5% раствор глютарового альдегида ("Sigma") на фосфатном буфере и фиксировали в течение 40 минут при комнатной температуре (в таком виде клетки могут храниться неограниченное время).

Перед непосредственным приготовлением препарата, клетки центрифугировали и дважды отмывали в избытке фосфатного буфера. Полученный в конечном счете осадок ополаскивали избытком дистиллированной воды (для отмывания остатков солей буфера).

Приготовление препарата. С помощью пастеровской пипетки вносили 0,5 мл клеточной взвеси в раствор фикол-верографина, перемешивали и в виде капли помещали на длинное покровное стекло ("Sigma"). Затем препарат накрывали вторым покровным стеклом, внутренняя сторона которого смазана тонким слоем глицерина, и равномерно придавливали к предметному стеклу, изгоняя пузырьки воздуха. Избыточный материал аккуратно удаляли. Для предохранения препарата от высыхания, покровное стекло (препарат) по краям герметизировали расплавленным парафином. При такой подготовке препарата неподвижность клеток сохранялась при любом положении препарата, если покровное стекло не контактировало с фронтальной линзой препарата.

Показатель преломления иммерсионной жидкости контролировался с помощью лабораторного рефрактометра типа Аббе.

Использование покровных стекол для приготовления препарата в данном случае необходимо для минимизации толщины препарата, что, в свою очередь, позволяет установить минимальное расстояние между освещающим и отражающим объективами схемы Маха-Цендера, лежащей в основе компьютерного микротомографа (5). Установление минимального расстояния (равного толщине препарата) между объективами позволяет увеличить диапазон углов сканирования исследуемого объекта (4).

Примеры.

Кровь больного В., взятую из вены (10 мл), развели в два раза физиологическим раствором, после добавления 2- 3 мл фикола центрифугировали при 3000 об/мин, удалили супернатант, оставшиеся клетки несколько раз отмывали в физиологическом растворе, после чего инкубировали в термостате при 37^oC, фиксировали в глютаровом альдегиде при комнатной температуре в течение 40 мин. Полученный таким образом лейкоконцентрат использовали для изучения ядросодержащих клеток при помощи компьютерного микротомографа. Для этого клетки отмывали от глютаральдегида, 0,5 мл клеточной взвеси смешивали с раствором фикол-верографина, и помещали на длинное покровное стекло. Затем препарат накрывали вторым покровным стеклом, внутренняя сторона которого смазана тонким слоем глицерина, и равномерно придавливали к предметному стеклу. Избыточный материал аккуратно удаляли. Для предохранения препарата от высыхания покровное стекло (препарат) по краям герметизировали расплавленным парафином.

Кровь больного Д. , взятую из пальца (1 мл), фиксировали при комнатной температуре в глютаровом альдегиде в течение 40 мин. Каплю отмытой от глютарового альдегида крови помещали в раствор фикол-верографина, перемешивали и затем наносили на длинное покровное стекло ("Sigma"). Затем препарат накрывали вторым покровным стеклом, внутренняя сторона которого смазана тонким слоем глицерина, и равномерно придавливали к предметному стеклу. Для предохранения препарата от высыхания, препарат по краям герметизировали расплавленным парафином. После чего приготовленные препараты использовались для исследования эритроцитов при помощи компьютерного микротомографа.

С помощью компьютерного микротомографа в препаратах, приготовленных по нашей методике, можно выявить трехмерное изображение клетки. В общем случае при наблюдении трехмерного объекта микроскоп формирует в плоскости изображения лишь некоторую двухмерную картину, оптически сопряженную с одним сечением объекта, на которую наложены изображения других расфокусированных сечений. Однако наиболее информативным для наблюдателя было бы получение изображений каждого сечения объекта независимо. При этом желательно иметь полную информацию о трехмерном объекте в памяти компьютера, что дает возможность наблюдать объемное изображение, используя всю мощь современной трехмерной графики, т. е. просматривать изображения сечений произвольной ориентации, устранять эффект затенения одной части объекта другой, формировать изображение объекта при выбранном уровне его плотности и т.д. Эти возможности позволяют реконструировать истинные размеры клетки.

Список использованной литературы
1. Ашмарин И.И. Краткое руководство по практической медицинской микробиологии. Т., Медгиз УзССР, 1961.

2. Высоцкий В.В., Волосникова И.В., Колпаков А.И. М. "Лабораторное дело", 1995.

3. Роскин Г.И. Микроскопическая техника. М.: Медгиз, 1951.

4. Handbook of Biological Confocal Microscopy, edited by J.B.Pawley, Plenum Press, New York and London, 1990.

5. S. Kawata, О. Nakamura, and S. Minami, Optical microscope tomography. 1. Support constraint, J.Opt.Soc.Am. A vol.4, 1987, pp 292-297.

Способ может быть использован в медицине, а именно в диагностике заболеваний системы крови при помощи компьютерного микротомографа. Препараты клеток крови приготавливают таким образом. Клетки выделяют по Воyum и помещают в иммерсионную жидкость, фиксируют их в течение 40 мин в глютаровом альдегиде, отмывают фосфатным буфером. В качестве иммерсионной жидкости используют раствор фикол-верографина, а препарат клеток помещают между двумя покровными стеклами, которые герметизируют расплавленным парафином. Данный способ позволяет выявить трехмерное изображение клетки. Способ менее длителен и позволяет определить истинные значения показателя преломления крови. 1 табл.

Способ приготовления препаратов клеток крови, включающий помещение выделенных по Boyum клеток в иммерсионную жидкость и их фиксацию, отличающийся тем, что клетки после их выделения фиксируют в течение 40 мин в глютаровом альдегиде, отмывают фосфатным буфером, а в качестве иммерсионной жидкости используют раствор фикол-верографина, а препарат клеток помещают между двумя покровными стеклами, которые герметизируют расплавленным парафином.