Способ хроматографического разделения пептидов Советский патент 1986 года по МПК G01N30/02 

Изобретение относится к биохимии, в частности к хроматографическому разделению и анализу биологически активных веществ.

Цель изобретения - повышение разрешающей способности метода и улучшение техники безопасности.

Способ осуществляется следующим образом.

Препарат, полученный из мозга кальмара, растворяют в 0,18 М ли- тийацетатном или литийцитратном буфере, доведенном до рН 2 соляной кислотой. Буфер содержит 10% муравьиной кислоты (буфер А). Полученный таким образом раствор наносят на колонку стандартного анализатора с сильным сульфокатионитом (0,6 х Х.25 см), используемым для анализа аминокислот. Все хроматографические операции проводят при 70°С. Колонку последовательно прокачивают со скоростью 30 МП/ч 10 мин, буфером Б {0,1 М литийацетатный или литийцит- ратный буфер, доведенный до рН 2,4 соляной кислотой, содержащей 1 % ме- тилцеллюлоз

тилцеллозол ва и 20 мин буфером В (0,25 М литийацетатньй или литий- цитратный буфер, доведенный до рН 3,0 соляной кислотой). Далее прокачивают через колонку в течение 35 мин буфер Г (0,4 М литийацетат- ный. или литийцитратн1 1Й буфер, доведенный до рН 3,0 соляной кислоты) и в течение 50 мин буфер Д (1,0 М литийацетатный или литийциТратный буфер, рН 7,0). Буферы Б-Е содержат 0,068 моль ацетата лития, соответствующие добавки гидроокиси лития до нужной молярности и на 1 л 2 мл 30%-ного раствора полиоксиэтиленгли кольлаурата, 2,5 мл тиодиэтанола . и 1 МП фенола.

Обнаружение пептидов проводят стадартной реакцией с нингидрином в проточном реакторе анализатора (скорость подачи нингидрина 20 мл/ч) и детектированием при 440-570 мм длине волны. Количественное определение осуществляют с помощью стандартного автоматического интегратора марки Shimadzu C-R1B.

Пример 1. Около 5 мг сухого пептидного препарата, полученного из ганглиев кальмара, растворяют в 150 мкл 0,18 М литийацетатного буфера,-доведенного до рН 2 соляной

5

кислотой, содержащего 10% муравьиной кислоты (буфер А).50-150 мкл раствора наносят на колонку стандартного анализатора аминокислот с сильным сульфокатионитом (0,6 х X 25 см), используемым для анализа аминокислот. Все хроматографические операции проводят при . Колонку последовательно прокачивают со скоростью 30 мл/ч в течение 10 мин буфером Б (0,1 М литийацетатный буфер, доведенный до рН 2,4 соляной кислотой и содержащий 1 % метилцелло- зольва) и в течение 55 мин буфером 5 В (0,25 М литиевый буфер, доведенный до рН 3,0 соляной кислотой), далее прокачивают через колонку 35 мин буфер Г (о,4 М литиевый буфер, доведенный до рН 3,0 соляной кисло- 0 той), 50 мин буфер Д (1,0 М литиевый буфер, доведенный до рН 3,4 соляной кислотой ) и 50 мин буфер Е (1,5 М литиевый буфер, рН 7,0). Буферы Б-Е содержат 0,068 моль ацетата лития, соответствующие добавки гидроксида лития до нужной моляр- ности и на 1 л - 2 мл 30%-ного раствора полиоксиэтиленгликоль лаура- та, 2,5 мл тиодиэтанола и 1 мл фено- 0 ла.

Обнаружение пептвдов кроводят стандартной реакцией с нингидринон в проточном реакторе анализатора Biotvomk LC-2000 (скорость пода- 5 чи нингидрина 20 мл/ч) с детектированием при 440 и 570 нм. Количественное определение осуществляют с помощью стандартного автоматического интегратора марки G-R1B Shimadzu. 40

Разделяющую способность метода оценивают по числу фракций на одно разделение (чистота фракций не менее 90%).

S П р и М е р 2. Пептидный препарат, полученный из ганглиев кальмара, подвергают разделению водными солями лития в условиях примера I при . Полученные результаты идентич- 50 ны результатам, полученным при . П р и М е р 3. Разделение тимали- на проводят в условиях примера 2 при . Разрешающая способность равна 40.

55 Пример4. Разделение тимали- на проводят в условиях примера 3 при 55 С.

Разрешающая способность равна 44.

П р и м е р 5. Разделение тимали на проводят в условиях примера 3 при .

Разрегааюшая способность равна 51

П р и м е р 6. Разделение тимали на проводят в условиях примера 3 при . Результаты идентичны результатам,- полученны; при .

Пример 7. Инкубация пе-птидн го материала в присутствии солей лития (рн 2,4 ) при в течение 2,5 ч приводит к деструкции пeпtид- ного материала.

П р И м е р 8. Пептидный препара полученный из ганглиев кальмара, подвергают разделению в условиях примера 4 с заменой ацетата лития н цитрат лития. Полученный результат идентичен результатам, полученным в условиях примера 4.

В таблице представлены сравнительные данные по разрешающей способности известного и предлагаемого способов.

Таким образом, предлагаеный способ обладает большей разрешающей способностью, чем известный и при его осуп1ествлении не используют токсичные реагенты.

Формула изобретения

Способ хроматографического разделения пептидов путем раствдрения анализируемой пробы в буферном растворе , нанесения полученного раствора на колонку стандартного анализатора с сульфокатионитом, многоступенчатого злюирования тем же буферным раствором при повьппенной температуре с последующей детекцией нин- гидрином, отличающийся тем, что, с целью повьппения разреСоставитель В.Шкилькова Редактор В.Данко Техред А.Кравчук Корректор Т.Колб

Заказ 5116/43 Тираж 778.Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Прюизводственио-полиграфическоё предприятие, г.Ужгород, ул. Проектная, 4

таюп1ей способности способа и улучшения техники безопасности, в качестве буферного раствора используют водный раствор на основе клорис- тоацетатного или хлористоцитрат- ного лития, а злюирование проводят при бО-ТО С.

20

5

0

5

Известный способ

Пример I ,

Пример 2,

45 С

Предлагаемый способ

Пример 3,

Пример 4, 70°С

Примел 5, 45°С

Пример 6, 55 С

Пример 7, 60 С

Пример 8, 70 С

15

30

45

45

40 44 51 5

Изобретение относится к области аналитической химии, в частности к хроматографическому разделению и анализу биологически активных веществ. С целью повьшения разрешающей способности метода и улучшения техники безопасности способ хрома- тографического разделения пептидов осуществляют растворением анализируемой пробы в буферном водном растворе с рН 2,4-3 на основе хлористо- ацетатного или хлористоцитратного литья, нанесением полученного раствора на колонку стандартного анали- «атора с сульфокатионитом и многоступенчатым элюированием тем же буферным раствором при температуре 60-70 С с последующей детекцией нингидрином при 440 и 570 нм. Разделяющая способность (число фракций с чистотой не менее 90% на одно разделение ) составляет 40-51 для пептидов тималина и 45 для пептидов калмара. 1 табл. сл ОС СП