Способ получения @ -амилазы Советский патент 1990 года по МПК C12N9/28 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению ферментов, и может быть использовано в научной и лабораторной практике.

Целью изобретения является повышение степени очистки фермента.

Способ получения rf-амилазы содер- :жит культивирование холерных вибрионов классического биовара, серовара Инаба, вакцинного штамма 569В в реакторе-ферментере, щелочной лизис при рН 10,5, нейтрализацию кислотой, инактивацию культуры холерных вибрионов мертиолатом, центрифугирование, фракционирование супернатанта сульфатом аммония, хроматографическое обессоливание и очистку методом гель- фильтрации на колонке с биогелем А-150М.

На чертеже приведен характерный тип хроматографического профиля.

Пример 1. В качестве источника фермента применяют холерные вибрионы классического биовара, серовара Инаба, вакцинного штамма 569В Выращивают холерные вибрионы в реакторе-ферментере в течение 10 ч в условиях аэрации при 34-36еС глубинным методом на бульоне из ферментативного гидролизата казеина, содержащего

200 мг аминного азота, 2% пептона; 0,5% NaCl; 0,05% двузамещенного фосфата Натрия, рН 8,0. Культивирование вибрионов продолжают до концентрации 55-65 млрд микробных клеток в 1 мл.

Культуру клеток обрабатывают щелочью. Максимальный выход наблюдается при концентрации щелочи 0,2%а что соответствует конечному значению рН 10,5, при экспозиции 18 ч.

Для доведения рН среды до исходного значения 8,0 щелочь нейтрализуют НС1 в конечной концентрации 4,4%.

Значения степени очистки амилазы (по конечному результату) в зависимости от концентрации NaOH и времени контакта приведены в табл. 1.

Показатели жизнеспособности холерный вибрионов при числе опытов 5 в зависимости от концентрации мертиола- та приведены в табл. 2.

Инактивирование жид ой -эеа торнот культуры холерных вибрионов проводят мер1лолатом. Оптимальной концентрация 0,1%.

Выбор концентрации 0,1% обусловлен по$ышением надежности действия мер- тиолата, так как при 0,08% инактиви- рование культуры не происходит. Увеличение дозы свыше 0,11% не изменяет бактерицидного действия, однако при этом происходит повышенный расход дорогостоящего препарата.

После инактивирования жидкой реакторной культуры и постановки тестов, подтверждающих ее стерильность ( в соответствии с требованиями режима работы г- возбудителями особо опасных инфекций, культуральную жидкость центрифугируют для отделения осадка клеток, вибрионов.

Влияние условий центрифугирования на эффективность формирования осадка ПРИ числе опытов 3 показано в табл.3. Оптимальным режимом при отделении клеток из культуральной жидкости является центробежное ускорение 4000g- 6000g в течение 25-30 мин. При 4000g четкий осадок клеток формируется начи н,ая с 30 мин; при 5000g - с 25 мин; при 6000g - с 15 мин. В целях сокращения времени и экономии электроэнергии для отделения клеток от культуральной жидкости используют ускорение 6000g в течение 15 мин.

Центрифугирование проводят при температуре не выше 4 С.

После центрифугирования осадок, содержащий разрушенные клетки, отбрасы0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

вают, надосодок, содержащий фермент, переносят в трехлитровую емкость и добавляют к нему сульфат аммония до 60% насыщения (на 1 л надосадка 390 г сухой соли), растворяют, перемешивают и оставляют для формирования осадка при комнатной температуре на 6 ч. Указанные условия являются оптимальными с точки зрения конечной степени очистки.

Результаты эффективности очистки амилазы (по конечному результату) при числе опытов 3 в зависимости от концентрации (NH)S04 и времени контакта приведены в табл. 4.

Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием. Оптимальными условиями центрифугирования являются 6000g в течение 10 мин (табл. 5). Центрифугирование проводят при 4°С, число опытов равно 3.

Отделившийся осадок растворяют в 0,005 М трис-HCl буфере, рН 7,6-7,7 в соотношении 1:1 и наносят на колонку с акрилексом Р-60. Оказанные молярное ть и рН буфера подобраны экспериментально и являются оптимальными (табл. 6), количество опытов равно J.

Соотношение объемов буфера и осадка, выбранное для растворения последнего, также установлено экспериментально. Самая эффективная (104 раза) очистка амилазы по конечному результату достигается именно в таком соотношении. При избытке буфера, т.е. превышении объема осадка в 1,25; 1,5; 2 раза и более, эффективность очистки соответственно составляет 90; 76; 68 и менее раз. При недостатке буфера, т.е. если объем в 1,25; 1,5; 2 и т.д. раз меньше, чем объем осадка, эффект очистки амилазы снижается и соответственно составляет 96, 86 и 58 раз. При объеме буфера меньшем объема осадка более, чем в 2 раза, отмечается лишь частичное растворение последнего, а следовательно, и невозможность нанесения образца на хромато- графическую колонку.

Обессоливание проводят на колонке с акрилексом Р-60. Указанный тип биогеля выбран потому, что только при его использовании происходит эффективное разделение (обессоливание) белкового осадка на ферментсодержащую и низкомолекулярную фракции. Сбор элюа- та производят под контролем оптической плотности при длине волны 280 нм

515730256

с помощью проточной спектрофотометри- наносят 45 мл обессоленного фермент- ческой кюветы. содержащего

раствора. Фракции по

обессоленного фермен

раствора. Фракции по

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению ферментов. Цель изобретения - повышение степени очистки фермента. Получение очищенной α-амилазы необходимо для изучения ее роли в иммунитете при холере. Способ получения амилазы заключается в культивировании холерных вибрионов классического биовара, серовара инаба, штамма 569В в реакторе-ферментере в условиях аэрации глубинным методом, лизисе клеток 0,2%-ным едким натрием при PH 10,5, нейтрализации среды доведением PH до 8,0 4,4%-ной соляной кислотой, инактивировании культуры 0,1%-ным мертиолатом, центрифугировании реакторной жидкости при 6000 G, насыщении надосадка, содержащего фермент, сульфатом аммония до 0,6, центрифугировании при 6000G с целью получения осадка, обессоливании растворенного в трис-HCI буфера осадка на колонке с акрилексом Р-60 и гельхроматографии обессоленного препарата на колонке с биогелем А-150М в 0,005М трис-HCI буфера PH 7,6. 1 ил. 10 табл.

При обессоливании из колонки выхо- 5-7 мл собирают на автоматическом кол- дят 2 пика: белковый, ферментсодержа- лекторе. Каждую фракцию изучают на со- щий и солевой (содержит сульфат аммония, мертиолат и др.).

Условия проведения хроматографии на колонке с биогелем Р-60: характедержание белка (по поглощению длины волны при 280 нм и более объективно по методу Лоури) и на активность амилазы. Из колонки выходят три белковых

ристика биогеля: пределы фракциониро- ю пика, склон первого пика содержит фервания по мол. м. 3000-60000 а.е.м.; мент амилазу.

размеры колонки 75 х 200 мм; объем в табл. 9 указаны результаты очистгеля 500 мл; скорость элюции 350- ки на разных этапах при числе опытов,

400 мл/ч; рабочий буфер 0,005 М трис- равном 30.

15

20

-НС1, рН 7,6.

Хроматографическую колонку с акри- лексом Р-60 уравновешивают тремя объемами указанного буфера. На поверхность наносят 150 мл растворенного в буфере ферментсодержащего осадка.

Полноту обессоливания оценивают качественной реакцией элюата с насыщенным раствором хлористого бария. После того, как основная часть обессоленного ферментсодержащего белка вы-25 ходит из колонки, производят отбор элюата по 0,2-0,5 мл. К этому объему добавляют 1-2 капли раствора хлористоКонечной формой хранения очищенной с/-амилазы является раствор, охлажденный до 4°С. В растворе элюирующего буфера в таких условиях препарат может храниться до четырех месяцев, сохраняя исходную активность, при комнатной температуре () наблюдается потеря ферментативной активности (число опытов равно 3, табл. 10).

Формула изобретения

Способ получения at-амилазы, заключающийся в обработке исходного матеСпособ получения at-амилазы, заклю чающийся в обработке исходного матего бария. При образовании белого осадка, указывающего на наличие ионов S0i)30 риала, фракционировании экстракта - сбор элюата прекращают.сульфатом аммония, центрифугировании

Процент потери на колонке при обессоливании рассчитывают по соотношению общего количества нанесенного и полученного после обессоливания фермент- мента

35

кого белка (число опытов 3, табл. 7).

Потери по белку составляют 3%, по активности потерь не было. Напротив, отмечается увеличение активности амилазы на 105%, т.е. приблизительно в два раза.

На заключительном этапе получения амилазы применяют гельхроматографию на колонке с биогелем А-150А. Гель выбран в связи с тем, что только он обладает эффектом разделения бессолен- ной ферментсодержащей белковой смеси (табл. 8).

Условия проведения хроматографии на колонке с биогелем А-150 М: характеристика биогеля: предел исключения по белку до 150 млн а.е.м.; размеры колонки 45 х 400 мм; объем геля 550 мл: скорость элюции 30 мл/ч; рабочий буфер 0,005 М трис-HCl, рН 7,6.

осадка с последующим обессоливанием, отличающийся тем, что, с целью повышения степени очистки фер- , в качестве исходного материала используют холерные вибрионы классического биовара, серовара Инаба, вакцинного штамма 569В в концентрации (55-65) Ю 5 клеток/мл, лизируют их ед

40 ким натром при значении рН суспензии клеток 10,5 в течение 18 ч для выхода фермента из периплазматического пространства в культуральную жидкость нейтрализуют среду доведением рН до

45 8,0 соляной кислотой, инактивируют культуру 0,09-0,11%-ным мертиолатом, центрифугируют реакционную жидкость, насыщают.надосадок сульфатом аммония до 0,6, центрифугируют для получения осадка, обессоливают растворенный в 0,005 М трнс.-IICl буфере рН 7,6-7,7 осадок при соотношении буфер осадок 1:1 на колонке с акрилексом Р-60 и хроматографируют обессоленный препарат на колонке с биогелем А-150А, элю

50

- - у pa. I raci. j ujiMxu c: t, nui K-ucri л i-jvi-ij j

Биогель уравновешивают тремя объе- ируя при Этом фермент 0,005 М трис- мами указанного буфера.. На поверхность -HCl-буфером рН 7,6.

Конечной формой хранения очищенной с/-амилазы является раствор, охлажденный до 4°С. В растворе элюирующего буфера в таких условиях препарат может храниться до четырех месяцев, сохраняя исходную активность, при комнатной температуре () наблюдается потеря ферментативной активности (число опытов равно 3, табл. 10).

Формула изобретения

Способ получения at-амилазы, заключающийся в обработке исходного материала, фракционировании экстракта - сульфатом аммония, центрифугировании

мента

5

осадка с последующим обессоливанием, отличающийся тем, что, с целью повышения степени очистки фер- , в качестве исходного материала используют холерные вибрионы классического биовара, серовара Инаба, вакцинного штамма 569В в концентрации (55-65) Ю 5 клеток/мл, лизируют их ед0 ким натром при значении рН суспензии клеток 10,5 в течение 18 ч для выхода фермента из периплазматического пространства в культуральную жидкость, нейтрализуют среду доведением рН до

5 8,0 соляной кислотой, инактивируют культуру 0,09-0,11%-ным мертиолатом, центрифугируют реакционную жидкость, насыщают.надосадок сульфатом аммония до 0,6, центрифугируют для получения осадка, обессоливают растворенный в 0,005 М трнс.-IICl буфере рН 7,6-7,7 осадок при соотношении буфер осадок 1:1 на колонке с акрилексом Р-60 и хроматографируют обессоленный препарат на колонке с биогелем А-150А, элю0

pa. I raci. j ujiMxu c: t, nui K-ucri л i-jvi-ij j

ируя при Этом фермент 0,005 М трис- -HCl-буфером рН 7,6.

римечание. + - вибрионы жизнеспособны; - - вибрионы убиты.

Таблица 1

Таблица 3

Примечание . осадок не отделяется,

+ - осадок рыхлый, возможны потери белка при отделении, + - плотный отделившийся осадок.

Таблицаб

Полярность трис-HCl буфера

Степень очистки, раз, в зависимости от рН трис-НС1

буфера

11

1573025

Надосадок культуральной жид- Кости после отделения фрагментов клеток вибрионов

Обессоленный ферментеодержа- ищи препарат после элюции t a Колонке с биогелем Р-60

Склон первого пика на колонке с биогелем А-150 М

12,8+1,4 4,1+0,5 0,32+0,08

593+0,23 9,2+0,6 V4iOs/ 0,23+0,09 7,7+0,6 33,59+1,2

Условия хранения

Активность фермента в единицах на 1 мг белка при сроке хранения, мес

1

Комнатная температура

(20-25°С)°33,6 26,4 20,8 16,2 8,0

Холодильник (+4°С) 33,6 33,4 33,3 33,3 30,2

го а so во юо по но ко w гоо мл

Составитель А. Семенов

Редактор Н. Бобкова Техред М.Ходанич Корректор л.Патай

Заказ 1621

Тираж 481

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

12 Таблица

Таблица 9

5,4

104,2

Таблица 10

LZTZTZI

6

28,4

Подписное