Устройство для хроматографического анализа аминокислот Советский патент 1982 года по МПК G01N31/08 

(5) УСТРОЙСТВО для ХРОМАТОГРАФИЧЁСКОГО АНАЛИЗА АМИНОКИСЛОТ

Изобретение относится к аналити ческой биохимии и может быть исполь зовано для ускоренного анализа аминокислот в белковых гидролиэатах и биологических жидкостях. Известно устройство для хроматографического анализа аминокислот, сос тоящее из термостатированной делитель ной колонки, насоса, прокачивающего, буферы на эту делительную колонку, автокрана, поочередно включающего буферы и емкости для этих буферов. На выходе из колонки к элюенту через смеситель подключается поток цветного реагента, который прокачивается вторым насосом из емкости .для нингидрина. Смесь элюента и раствора нингидрина в проточном капиллярном реакторе нагревается.- до 95-98° и окрашивается, а затем фотометрируется в проточной кювете. Сигналы фотоэлемента усиливаются и рег 1стрируются самопишущим потенциометром tl} Недостатком известного устройства является большая длительность процесса анализа. Наиболее близким к предлагаемому является устройство, состоящее из двух независимых каналов, включающих буферный насос, буферный автокран, буферные емкости и делительную колонку. Между колонками и насосами расположено автоматическое, дозировочное устройство с круглым коллектором на 72 пробы и двумя дозировочными петлями, одна из которых дозирует пробу на короткую колонку, а другая - на длинную. Под солонками расположен распределительнв й автокран, обеспечивающий очередность протекания буферов от короткой и длинной колонки на измерение, включающее один блок окрашивания, один блок детектирования и записи 2. Недостатком этого устройства является низкая производительность, невозможность выборочного анализа отдельных групп аминокислот (кроме основной) и проведения анализа из одной пробы. Цель изобретения - повышение ско рости анализа аминокислот. Указанная цель обеспечивается тем, что устройство для хроматографического анализа аминокислот, содержащее каналы для подачи буферных растворов, в каждом из которых уст новлены буферная емкость и буферный насос, приспособление для ввода про бы, хроматографическую колонку для разделения смеси аминокислот, на вы ходе которой установлен детектор, снабжено несколькими хроматографическими колонками для разделения групп аминокислот, установленных на выходе хроматографической колонки для разделения смеси аминокислот на группы, и двумя многовходовы 1Ми кранами-распределителями потоков, один из которыхустановлен меж ду каналами для подачи буферных рас воров и хроматографической колонкой для разделения смеси аминокислот на группы, а другой - между хро матографической колонкой для раздел ния смеси на группы и хроматографическими колонками для разделения групп аминокислот. На фиг. 1 представлена принципиальная схема предлагаемого устройства, осуществляющего разделение аминокислот с предварительным фракционированием; на фиг. 2 - 5 изоб ражены различные рабочие положения коммутирующих кранов-распределителей потоков. Устройство состоит из буферных емкостей 1, буферных автокранов 2, ;буферных насосов 3, манометров 4, автоматического дозировочного устройства 5, блока фракционирования 6, включающего многоканальный расп ределительный буферный автокран 7,м гоканальный распределительный фракци онный автокран 8,вспомогательные ко мутационные автокраны 9 и 10, фрикционные колонки 11 и 12. Под блоком фракционирования расположены делительные колонки: для разделения кислой фракции 13, нейтральной 14, тирозина сф6нилaлaнинoмj (и первой основной) 15, основной (и основной второй) 16. Система окрашивания и детектирования состоит из емкости для нингидрина 17, нингидриновых насосов 18, смесителей нингидрина с потоком буфера , в котором движутся фракции аминокидлот 19, реакционных капиллярных спиралей 20, фотометров с проточными кюветами 21 и блока записи 22. Разделение аминокислот на этом устройстве осуществляется непрерывным прокачиванием буферов из емкостей 1 насосами 3 JHa всех четырех каналах (1,П, Ш,1) на специализированные делительные колонки 13, 1,15 и 16. Давление на колонках контролируется манометрами. Смесь аминокислот при любых видах работ фракционируется поэтапно поочередной сменой операции автокранами 7 и 8. Необходимые буферы на все четыре канала подключаются актокранами 2. Фракционные колонки переключаются автокранами 9 и 10. Автокраны 7 и 8 занимают исходное положение .(фиг. 1) . Проба, дозированная автодозатором 5, расположенном на буферном канале 1, через центральный штуцер автокрана 7 и автокран 9 блока фракционирования 6, поступает на фракционную колонку 12. Нейтральная rpynrfa, тирозин с фенилаланином и основная группа удерживаются на смоле, а кислая кислым буфером уносится через автокраны 10 и 8 на делительную колонку 13, где и. начинается ее разделение. В это время на буферных каналах IJ, Ш и У буферы через автокраны 7 и 8 прокачиваются напрямую на делительные колонки Ikj 15 и 1б, минуя работающую фракционную колонку 12. Автокраны 7 и 8 занимают положение 2 (фиг. 2) . При этом нейтральный буфер канала И направляется через центральный штуцер автокрана 7 и автокран 9 на фракционную колонку 12, захватывает нейтральную группу аминокислот и через автокраны 10 и 8 уносит ее на делительную колонку k, где начинается окончательное разделение этой группы. В это время буферы по каналам Г, iTl и 1У прокачиваются на делительные колонки 13, 15 и 16 через автокраны 7 и 8, минуя фракционную колонку 12. Автокраны 7 и 8 занимают положение 3 (фиг. 3). Буфер канала (| направляется через центральный и.1туцер автокрана 7 и автокран 9 на фракционную колонку 12, захватывает тиро,59 с фенилаланином и через автокраны 10 и 8 уносит их на делительную колонку 15, где и происходит окончательное разделение этой пары. В это время буферы по каналам I, Д и 1У прокачиваются на делительные колонки 13, 1 и 16 через автокраны 7 и 8 , минуя .фракционную колонку 12 Автокраны 7 и 8 занимают положение J (фиг. 4). Основной буфер канала 1У через центральный штуцер автокрана 7 и автокран 9 поступает на фракционную колонку 12 и начинает разделение основной группы аминокислот. Если анализируется основная груп-5 па аминокислот белкового гидролизата и она на фракционной колонке 12 разделяется полностью,.необходимость в делительной колонке 16 отпадает. При анализе сложных смесей свободных ами 20 да нокислот на делительной колонке 1б окончательно разделяются аминокис лоты основной группы. В это время буферы по каналам Т,И и Ш прокачиваются на делительные колонки 13,I и 15, минуя фракционную колонку 12. Автокраны 7 и 8 занимают положение 5, автокраны 9 и 10 - положение (фиг. 5). При этом распределительный капилляр буферного распределительного автокрана 8, направляющий поток того или иного буфера к центральному штуцеру на вxoдe закрывается заглушкой, а буфер для разделения основных аминокислот на фракционную колонку 12 прокачивается через автокран 7 напрямую. В это время на фракционной колонке 12, а при необхо димости и на делительной колонке 1б, происходит разделение основной груп пьГ аминокислот, а на делительнЫх колонках 13,1 и 15 продолжают разделение другие группы. I После того, как последняя аминокислота кислой группы на делительной колонке 13 уйдет вниз по смоленастолько далеко, что ее не сможет догнать первая аминокислота со второ пробы, автокраны 7 и 8 занимают исходное положение (фиг. 1). Автодозатор 5 дозирует очередную пробу, которая кислым буфером уносится через центральный штуцер автокрана 7 и автокран 9 на фракционную колонку 11, и все в этой же строгой последовател ности, через те же интервалы времени повторяется сначала - и так проба за пробой. 7 Предлагаемое устройство позволяет значительно сократить время полного анализа как белковых гидролизатов, так и сложных смесей свободных аминокислот, так как общее время, затраченное на анализ смеси, суммируется всего из двух отрезков: полного фракционирования и одновременного и окончательного разделения полученных фракций (кислой, нейтральной, тирозина с фенилаланином и основной). Кроме того, в двухколоночном блоке фракционированид устройства при анализах белковых гидролизатов функционирование второй пробы на одной фракционной колонке совмещается с окончательным разделением основной группы первой пробы на другой фракционной колонке. Отсювремя полного анализа пробы оказывается равным времени,затраченному на разделение лишь однойфракции (например, основной - навторой фрак ционной колонке). Время анализа сокращается и за счет специализации делительных колонок, рассчитанных для разделения только какой-либо одной фракции, позволяющих, в связи с этим, значительно сократить высоту набивки смолы, обеспечивающей протекание буферов .до 70-100 мл/ч. Анализ одного образца белкового гидролизата может производиться за 30-АО мин против 2- ч на приборе известным способом. А время полного анализа сложной смеси свободных аминокислот сокращается до 5 м. Формула изобретения Устройство для хроматографическо го анализа аминокислот, содержащее каналы для подачи буферных растворов, в каждом из которых последовательно установлены буферная емкость и буферный насос, приспособление для ввода пробы, хрохатографическую колонку для разделения смеси аминокислот, на выходе которой установлен детектор, отличающееся тем, что, с целью ускорения процесса анализа, оно снабжено несколькими хроматографическими колонками для разделения групп аминокислот, установленных на выходе хроматографической колонки для разделения смеси аминокислот не группы, и двумя многовходовыми кранами-распределителями потоков, один из которых установлен между каналами для подачи буферных растворов и хроматографической колонкой для разделения смеси аминокислот на группы, а другой т между хроматографической колонкой для разделения смеси аминокислот на группы и хромаФиг. 9226 5

21

JlMUJl

mjiMUiiWL

Muot

.л.

18 гя

I

tflitt 78 тографическими колонками для разделения групп аминокислот. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1.Патент США ff 3551107, кл. 210-198, 1970. 2.Патент Великобритании № 1263 81, кл. В 1 d, 1972.