Способ идентификации возбудителя брюшного тифа Советский патент 1992 года по МПК C12Q1/04 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при идентификации энтеробактерий.

Известен классический способ идентификации возбудителя брюшного тифа, вы- бранный нами за прототип (Методические указания по микробиологической диагностике заболеваний, вызываемых энтеробактериями.

Способ осуществляется путем посева исследуемого материала на среды обогащения с последующим пересевом на селектив- ные пластинчатые среды, посевом выросших лактозоотрицательных колоний на 2-или 3-сахарные комбинированные среды и идентификацией культур по совокупности биохимических, серологических и фаго- лизабельных свойств.

Недостатком данного способа является невозможность диагностировать значи- тельную группу типичных бактерий брюшного тифа с несколько сниженной в пределах естественной вариабельности протеолитической активностью фермента тиосульфатредуктазы, дающих на комбинированных средах ложноположительную оценку лактозного признака и ложноотри- цательную - признака продукции сероводорода.

Целью изобретения является повышение точности способа.

v| 00

Ю Ю

ю

Цель достигается путем дополнительного отбора из комбинированных средах лактозоположительных, не образующих газ и сероводород культур, пересева на скошенную со столбиком лактозную среду, содержащую, г/л:

Агар8-9

Пептон2-3

Углевод10-15

Натрия хлорид4-5

Калия дигидрофосфат0,3-0,4

Натрия тиосульфат0,2-0,3

Бромтимоловый синий (0,2% водный раствор)11-12

Вода дистиллированнаядо 1 л рН 7,2-7,4. инкубирования посева при 37°С (24-72 ч), пересева культур, учтенных на предлЪжен- ной среде как лактозоотрицательные, на среды биохимического ряда, в котором са- харолитические свойства определяют на скошенных со столбиком моноуглеводных средах (маннит, сахароза, дульцит, араби- ноза и др.), а признак образования сероводорода на среде типа Клиглера при культивировании при 37°С не менее 4-5 суток с ежедневным контролем, определения серологических и фаголизабельных признаков и идентификации культуры по совокупности признаков, характерных для Salmonella typhi.

Пример 1. Исследуемый материал засевают в среды накопления, инкубируют в течение 18-24 часов при 37°С. Пересевают на пластинчатые селективные среды. Культивируют при 37°С в течение 20-24 часов. Выросшие лактозоотрицательные колонии пересевают на 2-х или 3-х сахарные комбинированные среды типа Клиглера. Культивируют при 37°С в течение суток. Отбирают лэктозоположительные, не образующие газ и сероводород культуры и пересевают их на скошенную со столбиком лактозйую питательную среду, содержащую, г/л: Агар8-9

Пептон2-3

Углевод10-15

- Натрия хлорид 4-5

Калия дигидрофосфат0,3-0,4

Натрия тиосульфат 0,2-0,3 Бромтимоловый синий (0,2 %-ный водный раствор)11-12

Вода дистиллированнаядо 1 л рН7,2-7.4

Посевы инкубируют 24-72 ч при 37°С, отбирают лактозоотрицательные культуры, засевают их на биохимический ряд, в котором расщепление маннита, сахарозы,

5 ксилозы, арабинозы, дульцита, сорбита определяют посевом на скошенные со столбиком моноуглеводные среды, а продукцию сероводорода инкубированием культуры на среде Клиглера с ежедневным контролем не

0 менее 4-5 сут. Определяют серологические и фаголизабельные признаки и идентифицируют культуру по совокупности всех признаков.

П р и м е р 2. Приготовление моноугле5 водной скошенной со столбиком среды.

Навеску хлорида натрия, углевода, пептона и двухзамещенного фосфата калия, гипосульфита предварительно растворяют в небольшом количестве дистиллированной

0 воды. В оставшейся дистиллированной воде при помешивании и подогревании до закипания растворяют агар. Затем все ингредиенты соединяют, перемешивают и добавляют индикатор. Устанавливают

5 ,2-7,4. Разливают в пробирки по 7-8 мл, стерилизуют при 0,5 избыточной атмосферы при 112°С в течение 20 мин. После стерилизации пробирки оставляют в слегка наклонном положении для получения ско0 шейного столбика. В готовом виде среда имеет травянистый цвет.

Применение среды: Испытуемую культуру засевают штрихом по скосу и уколом в столбик среды. После культивирования при

5 37°С в течение суток производят учет теста. В зависимости от степени активности определяемого сахаролитического фермента к моменту учета возможны следующие варианты:

0 При высокой степени активности - среда в скосе и в столбике; колонии на скосе окрашиваются в желтый цвет.

При средней степени активности - в желтый цвет окрашиваются лишь колонии

5 на скошенной части среды.

При слабой степени активности в случае замедленной ферментации среда сохраняет зеленую окраску и окончательно тест следует учесть через 48-72 часа.

0 Из данных табл. 2 видно, что у некоторых испытуемых культур ферментация углеводов (лактозы) происходит только в относительно анаэробных условиях столбика среды. В этом случае тест оценивают как

55 положительный при (переходе окраски в столбике среды из зеленой в ярко-желтую при одновременном появлении синей окраски в скошенной части. Газообразование учитывают в столбике по появлению пу- зырьков, разрывов среды.

Энтеробактерии, не расщепляющие соответствующий углевод, окрашивают скос среды в синий цвет за счет образующихся в небольшом количестве щелочных продуктов протеолиза, более интенсивно протека- ющего в аэробных условиях скоса. Сохранение зеленой окраски или слабое неспецифическое пожелтение столбика при одновременном окрашивании скоса среды в синий цвет оценивают как отсутствие со- ответствующего фермента у испытуемых бактерий.

ПримерЗ. Среда с минимальными значениями ингредиентов.

Среду готовят по примеру 2. Получен- ная среда имеет следующий состав, г/л: Агар8

Пептон2

Лактоза10

Натрия хлорид4

Натрия тиосульфат0,2

Калия дигидрофосфат0,3

Бромтимоловый синий (0,2% водный

раствор)11

Вода дистиллированнаяДо 1 л

рН7,2-7,4

Данные по идентификационным свойствам среды см. в табл. 1.

П р и м е р 4. Среда с оптимальными значениями ингредиентов.

Среду готовят по примеру 2. Полученная среда имеет следующий состав, г/л: Агар8,5

Пептон2,5

Лактоза12,5

Натрия хлорид4,5

Тиосульфат натрия0,25

Калия дигидрофосфат0,35

Бромтимоловый

синий (0,2 %-ный водный раствор)11,5

Вода дистиллированнаядо 1 л

рН7,2-7,4

Данные по идентификационным свой- ствам среды см. в табл. 1.

П р и м е р 5. Среда с максимальными

значениями ингредиентов.

Среду готовят по примеру 2. Получен-

ная среда имеет следующий состав (г/л): Агар9

Пептон3

Лактоза15

Натрия хлорид5

Натрия тиосульфат0,3

Калия дигидрофосфат0,4

Бромтимоловый синий12

Вода дистиллированнаяДо 1 л

рН7,2-7,4

Из данных табл.1 видно, что оптимальным является следующий состав среды, г/л: Агар8-9

Пептон .2-3

Углевод10-15

Натрия хлорид4-5

Калия дигидрофосфат0,3-0,4

Натрия тиосульфат0,2-0,3

Бромтимоловый синий (0,2% водный раствор)11-12

Вода дистиллированнаяДо 1 л

рН7.2-7,4

Уменьшение концентрации ингредиентов неблагоприятно для жизнедеятельности и выявления ферментативных способностей микробов. Увеличение концентрации ингредиентов ведет к чрезмерному осмотическому давлению в среде, что также затрудняет жизнедеятельность и выявление ферментативной способности микроорганизмов.

Из сравнительных данных табл. 2, 3 на приме е определения расщепления лактозы на х реде Гисса с лактозой, среде Клигле- ра и предлагаемой скошенной среде с лакто ой видно, что последняя обладает на- ибол- шей чувствительностью.

Из данных табл. 3 видно, что для ферментации углеводов (лактозы) у некоторых энтеробактерий имеет значение степень анаэробности условий. Для доказательства этого положения испытуемые культуры, учтенные на среде Клиглера как лактозоотри- цательные, пересевают для оценки лактозного теста на скошенную со столбиком агаризованную среду Гисса с лактозой (г. Махачкала НИИ по производству питательных сред) и скошенную со столбиком лактозовую среду.

П р и м е р 6. Сравнительная оценка ферментации лактозы на средах Клиглера, Гисса и скошенной лактозной среде (табл.2). Пример. Влияние на метаболизм лактозы аэробных (скос среды) и относительно анаэробных условий (столбик среды) (табл.3).

Для сохранения форм скошенный столбик в среду Гисса при приготовлении добавляют в количестве 8 г/л агар.

Основываясь на полученных данных, представленных в таблице 2 и 3, можно утверждать, что использование скошенной со столбиком моноуглеводной среды позволяет более достоверно определить расщепление углеводов при вариабельной активности соответствующего фермента, получить полуколичественную оценку теста и определить ферментативный (в относительно анаэробных условиях столбика) и респираторный (в условиях скошенной части) характер утилизации углеводов.

Более чем семикратная разница в концентрации углевода и пептона позволяет избежать маскирующего влияния щелочных продуктов протеолиза и создать преимущественные условия для образующихся кислых продуктов расщепления углеводов.

ПримерЗ. Влияние срока экспозиции на продукцию сероводорода у штаммов S. typhl на среде Клиглера.

П р и м е р 9. Влияние срока экспозиции на защелачивание скошенной части Клиглера при культивировании S. typhi.

Таким образом срок экспЪзиции культур S. typhi на средах типа Клиглера в 4-5 сут является оптимальным, т.к. он достаточен для выявления признака образования сероводорода. Уменьшение срока ведет к ложноотрицательной оценке признака образования Сероводорода; увеличение экспозиции может привести к гибели культуры.

Примерю. У больного В., у которого при оперативном вмешательстве установлена перфорация кишечника с подозрением на брюшнотифозную этиологию, была взята проба крови в количестве 12 мл. Произведен посев в 150 мл желчного бульона. Через 48 часов инкубации при 37°С был произведен высев из желчного бульона на-среду Эндо. Через 18 чёсов инкубирования при 37°С на среде Эндо выросли мелкие бесцветные колонии, которые были пересеяны на комбинированную дифференциальную среду Олькельницкого. Через 24 часа инкубирования при 37°С на скосе среды выросли мелкие изолированные колонии. Скос и столбик среды изменили розовую окраску на желтую, газообразование и продукция сероводорода отсутствовали. Культуры были оценены как ферментирующие глюкозу, лактозу, не продуцирующие газ и сероводород и не подлежащие дальнейшему исследованию согласно общепринятой схеме классического способа.

Культуры были пересеяны на скошенную со столбиком лактозную среду, см. пример 1. Через 24 ч инкубирования при 37 С культура была оценена как лактозоотрица- тельная (см. пример 2) и пересеяна на среду Олькельницкого и среды биохимического дифференцирующего ряда, в котором оценка теста расщепления углеводов производилась на скошенных со столбиком углеводных средах с соответствующими углеводами (ман- нит, сахароза, дульцит, ксилоза, арабиноза, сорбит, рамноза).

Через 72 ч инкубирования культуры на среде Олькельницкого отмечалось защелачивание скошенной части среды и продуцирование сероводорода.

После оценки тестов на средах дифференцирующего ряда культуры были оценены

как неферментирующие лактозу, сахарозу, дульцит, рамнозу, ферментирующие глюкозу, ксилозу, арабинозу, маннит, сорбит, де- карбоксилирующие лизин, не образующие индол, не утилизирующие цитрат и малонат

натрия, продуцирующие сероводород, подвижные грамотрицательные палочки, агглютинирующиеся сальмонеллезной сывороткой 09 и VI, Hd, лизирующиеся брюшнотифозным бактериофагом.

По совокупности этих признаков они были идентифицированы как бактерии брюшного тифа, что нашло подтверждение после повторной идентификации в Ростов- ской-на-Дону областной баклаборатории,

где выделенная культура была отнесена к фаговару Е I, второму ферментативному типу.

Указанный пример иллюстрирует вероятность диагностической ошибки при использовании комбинированных сред и повышение точности исследования при применении предложенного способа.

П р и м е р 11. Проба мочи в количестве 50 мл доставлена в лабораторию при обследовании Н, общавшегося с больным В.

Был произведен прямой посев на среду Плоскирева, Эндо. Через 20 ч на этих средах выросли мелкие бесцветные колонии, которые были пересеяны на среду Клиглера, инкубировались при 37°С. Через 24 ч снятые культуры были оценены как лактозоположи- тельные, не образующие газ и сероводород. Культуры были пересеяны на лактозную скошенную со столбиком среду и культивировались при 37°С в течение 24 ч и были оценены как лактозоотрицательные. Культуры были вновь пересеяны на среду типа Клиглера (предприятие центрального НИИВС им. И. И. Мечникова) и среды биохимического дифференцирующего ряда. Через 48 часов инкубирования на среде Клиглера отмечалось защелачивание скоса среды и продукция сероводорода.

По результатам испытания на средах

дифференцирующего ряда, включая скошенные со столбиком моноуглеводные среды, культуры по совокупности биохимических, серологических и фаголизабельных признаков были оценены как брюшнотифозные. После

повторной идентификации в Ростовской- на-Дону областной баклаборатории культура была отнесена к фаговару Е, второму ферментному типу.

П р и м е р 12. Проба испражнений

больного энтероколитом в количестве 1 г

была засеяна в селенитовый бульон на чашки со средой Плоскирева и Эндо. Через 20 часов инкубации при 37°С на среде Эндо и Плоскирева выросли мелкие бесцветные колонии, которые были пересеяны на среду типа Клиглера. Культуры культивировались при 37°С 24 ч и были учтены как лактозопо- ложительные, не образующие газ и сероводород, и пересеяны на скошенную со столбиком лактозную среду. Через 24 ч куль- тивирования при 37°С культура была учтена как лактозоположительная и не подлежащая дальнейшей идентификации на бактерии брюшного тифа.

Этот пример иллюстрирует, что в дан- ном случае оценка лактозного теста на среде Клиглера была достоверной.

Таким образом, использование предлагаемого способа дает возможность выявлять путем дополнительного отбора на 2-й 3-сахарном агаре лактозоположительных, не образующих газ и сероводород культур, и пересева их на лактозную скошенную со столбиком питательную среду, ранее не диагносцируемую значительную группу бактерий брюшного тифа и назначить соответствующее этиотропное лечение и провести своевременно необходимые противоэпидемические мероприятия.

Формула изобретения

Способ идентификации возбудителя брюшного тифа путем посева исследуемого

материала на среды обогащения с последующим пересевом на селективные пластинчатые среды, пересевом выросших лактозоотрицательных колоний на двух-или трехсахарные среды и идентификацией культур по совокупности биохимических, серологических и фаголизабельных свойств, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, дополнительно отбирают на комбинированных средах первичной идентификации лактозоположи- тельные, не образующие газ и сероводород культуры, пересевают на скошенную со столбиком лактозную среду, содержащую, г/л:

Агар8-9

Пептон2-3

Углевод10-15

Натрия хлорид4-5

Калия дигидрофосфат0,3-0,4

Натрия тиосульфат0,2-0,3

Бромтимоловый синий 0,2-ный водный раствор11-12

Вода дистиллированнаядо 1 л

рН7,2-7,4,

инкубируют в течение 24-72 ч, отбирают лактозоотрицательные культуры, определяют сахаролитические свойства на скошенных со столбиком моноуглеводных средах, а продукцию сероводорода - на средах типа Клиглера в течение 24-120 ч.

Использование: микробиология, идентификация энтеробактерий, бактериологическая диагностика. Сущность изобретения: на комбинированных 2 и 3 сахарных средах дополнительно отбирают лактозоположи- тельные. не образующие газ и сероводород культуры. Пересевают их на скошенную со столбиком лактозную среду, содержащую (г/л): агар 8,9; пептон 2-3; углевод 10-15; натрия хлорид 4-5; калия дигидрофосфат 0,3-0,4; натрия тиосульфат 0,2-0,3, бромти- моловый синий (0,2%-ный водный раствор) 11-12 мл, вода дистиллированная до 1 л, рН 7,2-7,4. Инкубируют посевы 24-72 ч при 37°С, отбирают культуры, дающие лактозо- отрицательную реакцию, пересевают их на дифференцирующий биохимический ряд,- определяют серологические и фаголиза- бельные свойства и индентифицируют культуры по совокупности признаков, характерных для бактерий брюшного тифа. Способ дает возможность выявлять ранее не диагносцируемую известным способом- значительную группу типичных бактерий брюшного тифа с несколько сниженной в пределах естественной вариабельности активностью протеолитических ферментов и фермента тиосульфатредуктазы. 5 табл. (Л С

Данные по идентификационным свойствам среды

Таблица 1

Таблица 2

Проодолжение табл.2

Таблица 3

Таблица 4

Таблица 5