ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ КЛЕБСИЕЛЛ Российский патент 2003 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 

Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологии, и может быть использовано, в частности, для бактериологической диагностики заболеваний, вызываемых клебсиеллами.

Клинические проявления клебсиеллезной инфекции чрезвычайно разнообразны, поэтому в установлении диагноза важная роль принадлежит бактериологическому исследованию.

Классический метод бактериологической диагностики состоит в выделении чистой культуры клебсиелл на плотных средах в среднем в течение 7-10 сут.

Обычно первичный высев материала для выделения чистой культуры производят на селективные и дифференциальные плотные среды, в которых заложен принцип ферментации лактозы (агары Плоскирева, Эндо, ЭМС-агар, Левина, Мак-Конки). Чаще на всех средах клебсиеллы образуют выпуклые, мутные, слизистые, гладкие колонии около 2-3 мм диаметром, но могут быть более мелкие, суховатые колонии, иногда с шероховатой поверхностью и неровным краем. Но на этих средах, обычно используемых для диагностики кишечных инфекций, трудно отличить колонии клебсиелл по цвету и морфологии от других представителей семейства кишечных бактерий. Изучение же большого числа сходных колоний делает исследование трудоемким и приводит к значительному расходу дифференциально-диагностических сред.

Известен ряд сред, основанный на принципе утилизации преимущественно клебсиеллами некоторых субстратов, на замене лактозы другими избирательными углеводами (инозит, рамноза) и добавлении антибиотиков (карбенициллин) или других ингибиторов (метиловый фиолетовый В и 2В, желчные соли). Однако все предложенные среды имеют те или иные недостатки. В основном они не способны дифференцировать клебсиеллы от энтеробактерий, что затрудняет проведение анализа. Те среды, в которых сохранялась питательная основа, недостаточно подавляли рост прочих энтеробактерий, несмотря на добавление в среду ингибиторов (В.И. Красноголовец, Б.С. Киселева. Клебсиеллезные инфекции. - М.: Медицина, 1996, С. 63-73, А.З. Равилов, Р.Я. Гильмутдинов, М.Ш. Хусаинов. Микробиологические среды. Казань: Фэн, 1999, С.146-152).

Наиболее близкой по составу к предлагаемой среде является среда Эндо, которую готовят следующим образом:
100 мл мясопептонного агара (МПА) (рН 7,4) растапливают на водяной бане, охлаждают до 70^oС и прибавляют 1 г химически чистой лактозы, предварительно растворенной в стерильной пробирке в небольшом количестве дистиллированной воды и прокипяченной.

В отдельных пробирках готовят: 1) 2-3 мл спиртового насыщенного раствора основного фуксина, 2) 10 мл 10% водного раствора сульфита натрия. В стерильную пробирку отмеривают 1 мл раствора фуксина и прибавляют раствор сульфита натрия до обесцвечивания фуксина (бледно-розовый цвет). Приготовленную смесь вливают в растопленный агар, хорошо перемешивают и разливают по чашкам. Горячий агар имеет бледно-розовый цвет, при застывании он становится бесцветным (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. /Под ред. М.О. Биргера. -3-е изд., перераб. и доп. -М.: Медицина, 1982, С.58-59).

На среде Эндо вырастают колонии клебсиелл красного цвета, однако на этой среде дифференциация клебсиелл от других лактозоположительных энтеробактерий невозможна. Поэтому отобранные с селективно-дифференциальной среды колонии пересевают на комбинированные среды различного содержания и далее на минимальный дифференцирующий ряд. Число тестов для полной идентификации представителей семейства Enterobacteriacea постепенно возросло и превысило 40. В связи с этим разработка сред, подавляющих рост посторонней микрофлоры и способствующих росту преимущественно клебсиелл, представляет несомненный интерес.

ЦЕЛЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ - повышение чувствительности среды для выделения клебсиелл.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве ингибитора сопутствующей микрофлоры и индикатора колоний клебсиелл среда содержит сафранин Т при следующем соотношении компонентов, г/л:
Сафранин Т - 1,0-3,0
Лактоза - 5,0-15,0
Мясопептонный агар до 1 л
рН 7,2-7,4
Предлагаемая питательная среда была апробирована на кафедре микробиологии Астраханской государственной медицинской академии на 50 образцах материала от больных и объектов окружающей среды в течение 2001-2002 г.г.

Ниже приводятся результаты апробации.

Пример 1
Для приготовления среды используют компоненты в следующих количествах, г/л:
- Сафранин Т - 2,0
- Лактоза - 10,0
- МПА - до 1 л
- рН 7,3
Навеску сафранина Т растворяют в 70% водно-спиртовом растворе и смешивают с предварительно расплавленным мясопептонным агаром, добавляют 10 г лактозы, предварительно растворенной в дистиллированной воде и прокипяченной. Перемешивают и стерилизуют при 0,5 атм в течение 20 мин. Цвет среды - темно-красный.

Расплавленную среду разливают в чашки Петри по 20-25 мл и оставляют в течение часа прикрытыми кружочками из стерильной бумаги для застывания. Посев исследуемого материала осуществляют на поверхность среды штрихом обычной бактериологической петлей. Инкубацию посевов осуществляют при 37^oС в течение 24 часов. Клебсиеллы образуют на поверхности среды крупные гладкие слизистые колонии темно-красного цвета с металлическим блеском диаметром 3-4 мм. Идентификация выделенных колоний проводится на общепринятых дифференциальных средах.

Пример 2
Среду готовят в соответствии с примером 1, но компоненты берут в следующих количествах, г/л:
- Сафранин Т - 1,0
- Лактоза - 5,0
- МПА - до 1л
- рН 7,2
Клебсиеллы формируют на среде крупные колонии темно-красного цвета.

Пример 3
Среду готовят в соответствии с примером 1, но компоненты берут в следующих количествах, г/л:
- Сафранин Т - 3,0
- Лактоза - 15,0
- МПА - до 1л
- рН 7,4
Колонии клебсиелл на среде крупные, имеют темно-красный цвет.

При посеве на предлагаемую среду 10, 100 клеток кишечной палочки, иерсиний, аэромонад, псевдомонад, листерий и стафилококков (по 5 штаммов) рост их существенно подавляется. При этом листерий, иерсиний и стафилококки не растут совсем. Кишечные палочки и псевдомонады формируют розовые плоские колонии диаметром 2-3 мм.

В таблице 1 даны результаты испытания трех вариантов предлагаемой среды.

Преимуществом предлагаемой среды является характерный вид выросших колоний клебсиелл, резко отличающийся от колоний сопутствующей микрофлоры.

Чувствительность предлагаемой среды выше, чем известной. Так, на предлагаемой среде клебсиеллы образуют на 15-20% колоний больше, чем на среде Эндо при одинаковых посевных дозах.

В таблице 2 даны результаты чувствительности известной и предлагаемой сред при посеве клебсиелл.

Таким образом, использование новой среды значительно повышает чувствительность бактериологического исследования, направленного на выявление клебсиелл в материале от больных и в объектах окружающей средын

Изобретение относится к области медицины, а именно к микробилогии, и может быть использовано, в частности, для бактериологической диагностики заболеваний, вызываемых клебсиеллами. Питательная среда для выделения клебсиелл сконструирована на основе мясопептонного агара и лактозы. Для ингибирования сопутствующей микрофлоры и выявления колоний клебсиелл среда содержит сафранин Т при следующем соотношении компонентов: сафранин Т - 1,0-3,0 г, лактоза - 5,0-15,0 г и мясопептонный агар в расплавленном состоянии - до 1 л, рН среды 7,2-7,4. Использование питательной среды с сафранином Т в качестве ингибитора посторонней микрофлоры и индикатора колоний клебсиелл позволяет повысить чувствительность среды. 2 табл.

Питательная среда для выделения клебсиелл на основе мясопептонного агара и лактозы, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит сафранин Т в качестве ингибитора сопутствующей микрофлоры и индикатора колоний клебсиелл при следующем количественном соотношении компонентов, г/л:

Сафранин Т 1,0-3,0

Лактоза 5,0-15,0

Мясопептонный агар До 1 л