СПОСОБ МУТАГЕНЕЗА ESCHERICHIA COLI Советский патент 1994 года по МПК C12N15/90 

Изобретение относится к области молекулярной генетики и генетической инженерии и может быть использовано для мутагенеза и маркирования ДНК хромосомы и плазмид бактерий.

Целью изобретения является расширение числе реципиентных штаммов за счет снятия ограничений по генотипу amber⁺, ( λ ) , λ^R .

Поставленная цель достигается тем, что вносят транспозон Tn5 с помощью конъюгативной чужеродной неспособной к существованию в клетках E. coli плазмиды pJB5JI.

Способ осуществляют следующим образом.

Проводят скрещивания донорных бактерий Rhizobium, несущих конъюгативную плазмиду pJB5JI с транспозоном Tn5, с реципиентными бактериями E. coli и отбирают устойчивые к канамицину K_m-R клоны, являющиеся потомством бактерий E. coli с транспозоном Tn5 в составе их генома.

П р и м е р 1. Бактерии штамм R. leguminosarum 897 (T) (phe, trp, str, pJB5JI) - донор и E. coli HB101 (leu, pro, lac, gal, thi, str, recA, r^-, m^-) - реципиент подращивают в течение 13 ч при 30^оС в жидкой полноценной среде МК, смешивают в соотношении 5: 1 (донор: реципиент), осаждают центрифугированием, переносят на поверхность агаризованной среды МК и инкубируют в течение 15 ч при 30^оС. Далее бактерии смывают стерильным буфером, высевают на агаризованную богатую среду LB c 30 мкг/мл канамицинсульфата K_m и выращивают при 37^оС. На среде LB бактерии донора R. leguminosarum 897 (T) не растут; в таких условиях вырастают только K_m-R бактерии E. coli, содержащее транспозон TnS.

П р и м е р 2. Способ осуществляют как в примере 1, но в качестве реципиентных бактерий берут штамм E. coli BH101 λ^R. По- лучены K_m-R клоны бактерий Е. coli, содержащие транспозон Tn5.

П р и м е р 3. Способ осуществляют как в примере 1, но в качестве реципиентных бактерий берут E. coli К12 (λ). Получены K_m-R клоны бактерий E. coli, содержащие транспозон Tn5.

П р и м е р 4. Способ осуществляют как в примере 1, но в качестве бактерий берут E. coli W3350 (amber-). Получены K_m-R клоны бактерий E. coli, содержащие Tn5.

П р и м е р 5. Способ осуществляют как в примере 1, но в качестве реципиентных бактерий берут E. coli S17P (pro, res, recA, [RP4 (Tc: Mu) (K_m: Tm7)] pSVP 202 и конъюгационную смесь высевают на среду LB, содержащую 30 мкг/мл канамицинсульфата и 10 мкг/мл тетрациклина. Выросшие клоны бактерий далее скрещивают со штаммов E. coli ВН 101 для поиска вариантов, несущих pSVP202: Tn5 плазмиду (отбор на среде LB со стрептомицином (200 мкг/мл) и канамицинсульфатом (30 мкг/мл). Получены плазмиды pSVP202: : Tn5.

Примеры 1-4 иллюстрируют возможность эффективного внесения транспозона Tn5 с помощью плазмиды pJB5JI в ДНК хромосомы различных штаммов E. coli. Частота появления K_m-R бактерий в этих примерах примерно одинакова и составляет величину (1-5) x 10^-5 на клетку реципиента. В параллельных контрольных экспериментах K_m-R мутантов спонтанного происхождения у использованных штаммов E. coli нет (частота ниже 1 x 10^-9). Проверка Km-R бактерий E. coli (по 12 клонов из каждого примера) с помощью модифицированного метода Экхардта показала, что плазмиды pJB5JI в клетках нет. Не удалось также перенести свойства K_m-R из этих бактерий в K_m-S штаммы E. coli или R. leguminosarum путем скрещивания. На этом основании предполагается, что плазмида pJB5JI в клетках E. coli существовать не может и K_m-R клоны возникают вследствие транспозиции с нее Tn5 транспозона в ДНК хромосомы реципиентных бактерий E. coli. Данное предложение подтверждается фактом выделения из K_m-R клонов бактерий ауксотрофных мутантов и возможностью перетранспозиции K_m-R признака. Из каждого скрещивания (примеры 1-4) отбирают и проверяют на ауксотрофность 500-600 K_m-R клонов бактерий E. coli. Во всех случаях находят различные ауксотрофные мутанты (по основаниям нуклеиновых кислот и аминокислотам) с частотой около 1% . С такой же примерно частотой Tn5 индуцирует образование ауксотрофных мутантов у водородных бактерий и с несколько меньшей - у ризобий. В один из выделенных K_m-R, ade-мутантов E. coliz К12 (пример 3) переносят трансмиссибильную плазмиду pPHJI и далее в скрещиваниях с E. coli С600 определяют частоту перетранспозиции на нее K_m-R признака. Эта частота равна 1 x 10^-5, т. е. характерна для перетранспозиции Tn5.

П р и м е р 5 иллюстрирует возможность эффективного введения транспозона Tn5 в плазмиды E. coli. Берут реципиентный штамм E. coli S17P (pro, res, recA [RP4 (Tc: : Mu) (K_m: : Tn7) с плазмидой pSVP202 (pBR325, несущая oriT фрагмент мол. м. около 2 млн дальтона из RP4). Плазма pSVP202 мультикопийна и в данном штамме E. coli высокотрансмиссибильна. Введение в нее транспозона Tn5 можно легко детектировать по увеличению молекулярной массы и 100% -ному переносу плазмидой в скрещиваниях с другими штаммами E. coli признака K_m-R. В скрещиваниях R. leguminosarum 897 (Т) с E. coli S17P гибридные плазмиды pSVP202: : Tn5 находят в 5-10% образующихся Km-R клонов бактерий E. coli. (56) De Bruijn F. T. , Lupski L. R. The use of transposon Tn5 mutagenesis in the rapid generation of correlated physical and genetic maps of DNA segments cloned into multicopy plasmids. - A review Gene, 1984, v. 27, N 2, p. 131.

СПОСОБ МУТАГЕНЕЗА ESCHERICHIA COLI, включающий внесение траспозона Tn5 в реципиентные клетки с последующим отбором полученных мутантов по устойчивости к канамицину, отличающийся тем, что, с целью расширения числа реципиентных штаммов за счет снятия ограничений по их генотипу amber^t( λ) , λ^R , внесение Tn5 осуществляют с помощью плазмиды pJB5JI.