Плазмидная ДНК pMTF59, предназначенная для транспозонного мутагенеза бактерий семейства ЕNтеRовастеRIасеае Советский патент 1990 года по МПК C12N15/00 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно генетической инженерии.

Целью изобретения является конструирование плазмиды pMTF59, содержащей транспоэоны Тп 5, Тп 9 и проявляющей температурную нестабильность в клетках Enterobacteriaceae при 37°С, которую можно использовать для транспозонного мутагенеза представителей этого семейства.

Плазмида pMTF59 является генетически модифицированным вариантом плазниды рМ38, обнаруженной ранее в клетках штамма Pseudomonas Зр.И, и получена путем встраивания в состав плазмиды рМ38 транспозонов Тп 5 и Тп 9„

Плазмида pMTF59 включает детер- tинaнтy устойчивости к стрептомицину (Sm), транспозоны Тп 5 (Кт ) и Тп 9 (Cm), а также область, ответственную за репликаххию и температурную нестабильность при , которая локализована ,в участке ДНК протяженностью 6,9 т,п.о. и состоит из следующих элементов: Sma I-Uba 44- фрагмент (0,9 т.п.о,); Uba 44 - Hind III - фрагмент (1,8 т,п,о,); Hind III - Bgl II - фрагмент (0,2 т.п.о.): Вр1 II - Hind III - фраг- мент (1,0 т.п.о.); Hind III - Sma I (0,1 т.п.о.).; Sma I - Eco 147 - фрагмент (1,2 т.п.о.); ECO 147 - Ii - фрагмент (0,1 т.п.о.); Бр,1 II - Есо 1471 (1,6 т.п.о.) - фрагмент.

д

Мол, м. плазмиды 40,8 Mg - размер

61 ,. Т.П.Оо

Плазмида pMTF59 сообщает клеткам, в которых она находится, устойчивость к трем антибиотикам - стрептомицину, канамицину и хлорамфениколу.

Плазмида pMTF59 конъюгативна и передается пшрокому кругу хозяев семейства Enterobactertaceae с час- тотой 10 -10-, а в гомологичные штаммы с частотой клетку дфнора.

1 Плазмида находится в бактериях штам1 1а E.coli C600/pMTF59, который хранится во Всесоюзной коллекции промьшленных микроорганизмов института ВНИИгенетика под № ВКИ В-4309.

Плазмида pMTF59 обладает уникаль- ной способностью наследоваться в не- сёлективных условиях в клетках любого штамма семейства Enterobacteria- сбае при и утрачиваться со 100%-ной частотой .при .

Пример 1. Клетки штамма E«coli СбОО, содержащие плазмиду pMTF59, выращивают в течение 18 ч в жидкой питательной среде при , осаждают центрифугированием в тече- нйе 15 мин при 15000 f, и ресуспенди- руют в прежнем объеме физиологичес- кбго-раствора. Затем из соответству- разведений делают высевы на плотную питательную среду, содержащую ка- намицин в концентрации 25 мкг/мл для отбора вариантов с транспозицией Тй 5. Чатки с питательной средой перед засевом предварительно прогревают при в течение 20-30 мин. После посева бактерии культивируют при в течение 24-48 ч и затем выросшие кЛоны проверяют на устойчивость к остальным плазмидным маркерам. Клоны, наследуювще только один маркер, со- оТветствующий транспозону Тп 5,(Km ) появляются с частотой 8,8-10 (по отношению к исходному количеству кле- ток перед посевом). а среди них с частотой 1,1% отбирают ауксотрофные 1иутанты.

Пример 2. Для получения ауксотрофных мутантов используют штамм Erwinia herbicola 103K/pMTF59 Способ получения ауксотрофных мутантов такой же, как и в примере 1, раз личия состоят в том, что частота транспозиции транспозона Тп 5 в хромосому этого штамма 9,9-10 ,

-

0

а ауксотрофные мутанты отбирают с частотой 5,5%.

Пример 3. Для получения ауксотрофных мутантов используют фитопатогенных бактерий Erwinia chrysanthemi ENA 49/pMTF59. Способ получения ауксотрофных мутантов такой же, как и в примере 1, различия состоят в том, что частота транс- позиции транспозона Тп 5 в хромосо- му этого штамма 1,2-10, а ауксотрофные мутанты отбирают с частотой 2,0%.

Пример 4. Для получения ауксотрофных мутантов используют штамм фитопатогенных бактерий Erwi- nia species 106-7/рМ:ТР59. Способ получения ауксотрофных мутантов такой же, как и в примере 1, различия состо гт в том, что частота транспозиции транспозона Тп 5 в хромосому этого штамма 5,, а ауксотрофные мутанты отбирают с частотой 1,5%.

Пример 5. Для получения ауксотрофнык мутантов используют штамм Citrobacter freundii 467/pMTF59. Способ получения ауксотрофных мутантов такой же, как и в примере 1, различия состоят в том, что частота транспозиции транспозона Тп 5 в хромосому этого штамма 1,2-10, а ауксотрофные мутанты отбирают с частотой 0,5%.

Пример 6. Для получения ауксотрофных мутантов используют штамм Klebsi2lla pneumoniae 62-1/pMTF59. Способ получения ауксотрофных мутантов такой же, как и в примере 1, различия состоят в том, что частота транспозиции транспозона Тп 5 в хромосому этого штамма 6,7-10, а аук-, сотрофные мутанты отбирают с частотой 0,36%.

Пример 7. Для получения ауксотрофных мутантов используют штамм Salmonella typhimurium 487/pMTF59. Способ получения ауксотрофпых мутантов такой же, как и в примере 1, различия состоят в том, что частота транспозиции транспозона Тп 5 в хромосому этого штамма 3,1-10, & ауксотрофные мутанты отбирают с частотой 2,0%„

Пример 8. Для получения ауксотрофных мутантов используют штамм Serratia marcescens B-l40/pMTF59. Способ -получения ауксотрофных мутантов такой же, как и в примере 1, рая

личия состоят в том, что частота транспозиции транспозона Тп 5 в хромосому этого штамма соответствует , 2,010-, а ауксотрофные мутанты отбирают с частотой 0,4%, Таким образом, предлагаемая плазм да pMTF59 проявляет температурную не . стабильность при , что позволяет с высокой эффективностью вводить транспозон Тп 5 (или Тп 9) в клетки любого штамма семейства Enterobacte- riaceae и осуществлять транспозонный мутаге7 ез с целью получения необходимых ауксотрофньк мутантов. Предлагаемая гшазмида pMTF.59 по сравнению с известными имеет следуюпще преимущества: не может реплицироваться в бактериях при , поэтому для отбора мутантов нет необходимости исполь- зовать температуру , что значительно расширяет круг штаммов семейства Enterobacteriaceae, которые можно использовать для транспозонного. мутагенеза с помощью данной плазмиды; обеспечивает высокую частоту транспозиции (доходящей до 1,3-10-1) транс- позонов в хромосому новых бактериальных штаммов и отбор необходимьпс ауксо трофных мутантов, Плазмида pKTF59 мо- жет быть использована для получения мутантов не только с помощью транспозона Тп 5, но также и второго транспозона (Тп 9), входящего в состав данной плазмиды. Плазмида предла

1599434

гается для получения транспозонных мутантов у представителей различных : родов и видов семейства.

Фор

мула ияобретени

Плазмидная Л1ГК pMTF59, предназначенная для транспозонного мутагенеза бактерий семейства Enterobacte- riaceae молекулярной массой 40,8 MR и размером 61,2 т.п,н,, содержащая плазмиду рМ28 мол.м„ 35,1 Мр и размером 52,7 т.п.н., в которой Sma I - Есо1471 участок мол.м, 4,6 Mg и размером 6,9 т.п.н,, с уникальным сайтом для эндонуклеазы рестрикции ЕсоТ471, ответственен на репликацию и температурную нестабильность в бактерия:: семейства Enterobacteria- сеае;

-транспозон Тп 5 мол.м. 3,9 Mg и размером 5,8 т.п.н.;

-транспозон Тп 9 мол.м. 1,8 Mg и размером 2,638 т.п.н.;

-генетические маркеры:

-ген Km (Тп 5) - устойчивость к канамицину;

-ген Cm (Tn 9) - устойчивость к хлорамфениколу;

-ген Sm - устойчивость к стрептомицину;

конъюгативна и может передаваться широкому кругу хозяев бактерий.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к генетической инженерии. Цель изобретения - конструирование PMTF59 мол. м. 40,8 MG, содержащая транспозоны TN 5 и TN 9 и проявляющая температурную нестабильность в клетках ENTEROBACTERIACEAC при 37°С, которая предлагается для транспортного мутагенеза представителей этого семейства. Плазмида PMTF 59 состоит из плазмиды PM 38, в которую встроены транспозоны TN 5 и TN 9. Плазмида детерминирует устойчивость к стрептомицину, канамицину и хлорамфениколу. SMA I - ECO 1471 - фрагмент плазмиды PMTF 59 ответственен за репликацию и температурную нестабильность плазмиды в бактериях семейства ENTEROBACTERIACEAE. Плазмида PMTF 59 коньюгативна и может передаваться широкому кругу хозяев бактерий.