Способ получения штамма клубеньковых бактерий люцерны Советский патент 1993 года по МПК C12N15/07 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, в частности к получению штаммов клубеньковых бактерий с улучшенными свойствами.

Цель изобретения - предложить генетический способ получения штаммов клубеньковых бактерий люцерны, сохранивших высокую азотфиксирующую активность и симбиотическую эффективность исходных штаммов и повысивших их за счет увеличения количества клубеньков, образуемых полученными штаммами, повысивших свою конкурентоспособность, что закреплено наследственно. В качестве такого способа предлагается проводить триродительское скрещивание штаммов клубеньковых бактерий люцерны. Agrobacterium rhizogenes Д 32 15834, содержащего плазмиду pPON, и бактерий Escherichia coli сбОО, несущего плазмиду RP4-4, и отбирать клоны, Плазми- да pPON получена на основе собственной корне индуцирующей плазмиды штамма

Agrobacterium rhizogenes 15834 путем маркирования ее транспозоном Tn5-mob. Донором плазмиды pPON служит штамм Agrobacterium rhizogenes Д 32 (штамм 15384, промаркированный указанным транспозоном), устойчивый к рифампицину и канамицину в концентрации, соответственно, 40 и 200 мкг/мл. Плазмида pPON имеет молекулярную массу в 258 М и представляет собой коинтеграт двух плазмид меньшей массы (107 и 154 М), поэтому в клетках Rhizoblum melllotl она может быть представлена в виде трех плазмид с молекулярной массой 107, 154 и 258 М. Эта плаз- мида несет гены, контролирующие индукцию бородатых корней у штаммов Agrobacterium rhizogenes (White F.F., Nester E.W. Hairy root: plasmid encodes virulence traits in Agrobacterium rhizogenes - J. Васк. о.. 1980, 141.3, 1134-1141). Донором плазмиды RP4-4, несущей гены устойчивости к тетрациклину и ампициллину (конценЁ

00

ю ю

00 00

OJ

грация антибиотиков в среде, соответственно, 20 и 100 мкг/мл), служит штамм Escherichla coll C600 (Simon R. High frequency mobilization of gram-negative bacterial repllcons by the In vitro constructed Tn5-mob transposon. - Molec. ben. benet - 1984, 196.3. 413-420.

Сущность изобретения поясняется следующими примерами его реализации.

а П р и м е р 1. Трехродительские скрещивания проводят на питательной среде следующего состава: КаНРОз - 0,5 г; MgSOi x х7Н20 - 0,2 г; NaCI - 0,1 г; СаСОз - следы; маннит - 10,0 г; дрожжевой экстракт - 0.5 г; вода дистиллированная - 1 л. рН 7,0-7,2. Выращивание при 28°С в течение 24 ч. Густые суспензии родительских штаммов наносят каплями на агаризованную среду указанного состава (20,0 г агара на 1 л среды). Через 16-18 ч клетки собирают в пробирки с 1 мл стерильной воды и высевают на чашки Петри с указанной агаризованной средой с добавлением антибиотиков - кана- мицина и стрептомицина (1000 мкг/мл) или канамицина и новобиоцина (120 мкг/мл). Одновременно на эти среды высевают контрольные варианты, из которых делают разведения с высевом на указанную питательную среду для определения частоты появления рекомбинантов, Реципиент- ный штамм клубеньковых бактерий люцерны должен быть маркирован устойчивостью к стрептомицину или новобиоцину. Клоны рекомбинантов появляются на 4 сутки при выращивании при 28°С. В наших опытах было выявлено 3 независимых скрещивания, частоты появления канамицин-ус- тойчивых клонов у штамма CXMI-105 Rhizoblum melllotl составляли . Из каждого скрещивания отбирали по 3 реком- бинанта и проверяли их симбиотические свойства в условиях стерильного микровегетационного опыта на растениях люцерны сорта Зайкевича. В большие пробирки объемом 60 мл вносили по 5 г вермикулита, промытого и прокаленного при 800°С в течение 2 ч. В каждую пробирку добавляли по 10 мл среды Красильникова-Кореняко следующего состава: К2НР04 - 1 г; MgS04 - 1 г; Саз(Р04)а - 0,2 г; FeS04 - следы; вода дистиллированная - 1 л. Пробирки со средой стерилизовали в автоклаве. Семена люцерны стерилизовали концентрированной серной кислотой а течение 5 минут, промывали стерильной водой и проращивали до появления корешка размером 3-6 мм (1-2 суток) при 28°С. Проростки раскладывали по 2 в каждую пробирку. Клубеньковые бактерии для инокуляции растений выращивали на агаризованной среде указанного выше состава (без антибиотиков) при 28°С в течение 2 суток и суспендировали в растворе микроэлементов: НзВОз - 0.05 г; (NH4)2MoCM - 0,05г; KCI - 0,005 г: NaBr - 0.005 г; ZnSCM x

х7Н20 - 0,03 г; А12(5См)з х 18Н20 - 0.003 г; MnS04 - 0,002 г; вода дистиллированная - 1 л. Через сутки после посева семян в каждую пробирку вносили по 1 мл инокулюма (10 - 108) кл/мл. Опыты ставились в 12-кратной

повторности. Растения выращивали в теплице при 25°С в течение 30 дн. По истечении 30 дней пробирки герметично закрывали и вводили в них шприцем ацетилен до концентрации 10% по обьему. Количество эти5 лена, образовавшегося в результате восстановления ацетилена нитрогеназой клубеньковых бактерий, определяли через 24 часа на газовом хроматографе. Величину ацетиленредуктазной активности клубень0 ков, являющуюся показателем интенсивности работы нитрогеназы, определяли по формуле М(С2Н2)

Jnp. .

VCT. x V

.

let. л Vnp. x 22.4 5 где М(С2Н2 - ацетиленредуктазная активность клубеньков (ммоль/сос 24 ч);

1Пр - длина пика этилена, полученного при введении исследуемой пробы;

1ст. - длина пика, полученного при вве- 0 дении стандартной пробы 0,1 % этилена; VCT. - обьем стандартной пробы; Vnp. - обьем исследуемой пробы; V - обьем пробирки с растениями. Способность к индуцированию боро- 5 датых корней исследовали на раневых поверхностях листьев табака в асептической культуре по методике, описанной в работе Bercetohe J. Chrignl D., Adam S.. David C., Morphogenetic and cellular reorl entations 0 induced by Agrobacterlum rhlzogenes (strains 1855, 2659 and 8196) on carrot, pea and tobacco - Plant Scl. 1987. 52, 3, 195-210.

Семена табака стерилизовали раствором 30% перекиси водорода и 96% этило- 5 вым спиртом, взятым в соотношении 1:1, в течение 10 минут. Затем их помещали на среду Мурасиге и Скуга без гормонов (мг/л) : NH4N03 - 1650; КШз - 1900; CaCl2 x 2НаО

-440; MgSO x 7Н20 - 370; КН2Р04 - 170; 0 НзВОз - 6.2; MnS04 x 4Н20 - 22.3; CoCI2 x

х6Н20 - 0.025; CuSO x 5Н20 - 0,025; ZnS04 х 7Н20 - 8.6; Na2Mo04 x 2Н20 - 0,25; KJ - 0.83; FeS04 х 7Н20 - 27.8; Na2 ЭДТА х 2Н20

-37,3; тиамин-НС - 0,1; пиридоксин - HCI 5 - 0.5; никотиновая кислота - 0,5; мезо-инозит - 100; глицин - 2,0: индоксилуксусная кислота - 2.0; кинетин - 0,2: сахароза - 30000. рН 5,6 - 5,8. Выращивали в течение 2-3 недель. Срезанные листья проростков

надсекали перпендикулярно главной жилке и помещали в суспензию клубеньковых бактерий, выращенных в течение суток на качалке в жидкой среде с маннитом и дрожжевым экстрактом приведенного в примере 1 состава. В бактериальной культуре листья табака выдерживали 1-2 часа и переносили на среду Торри без гормонов (мг/л): MgSCM x 7Н20 - 42; Са(МОз)2 x 4Н20 -242;ШОз-85;КС1-61:КН2Р04-20;РеС1з - 1,5; MnSOi x Н20 - 4.5: ZnS04 x 7Н20 - 1,5; НзВОз- 0,25; Na2Mo04 x 2Н20 - 0.25; CuSCU х 5Н20 - 0.04; никотиновая кислота - 5,0; тиамин-НС - 1,0; сахароза - 60000. рН 6,0. Выдерживали 12 ч и перекладывали на среду Мурасиге и Скуга указанного состава с добавлением 0,25 мг/л бензиламинопурина и 0,05 мг/л а-нафтилуксусной кислоты. Учет патогенности проводили на 14 день после инокуляции. Характерный фенотип бородатых корней: корни, индуцированные патогенными рекомбинантами, отличаются от нормальных корней тем, что они быстрее растут, сильнее разветвлены, имеют вертикальное и горизонтальное направление, а не только вниз. Растения, регенерированные из трансформированных корней, сильно ветвятся, имеют сморщенные листья.

Результаты микровегетационного опыта и определение способности к индуцированию бородатых корней представлены в табл.1.

Как видно из табл.1, ацетиленредуктаз- ная активность не отличалась достоверно от контрольного варианта (за исключением штамма под № 9). что указывает на сохранение азотфиксирующей активности штамма- реципиента. (Масса растений также не различалась, поэтому данные о ней не приводятся). Восемь из полученных штаммов обладали усиленной вирулентностью и образовывали большее количество клубеньков на растениях люцерны, чем штамм-реципиент. Все полученные штаммы, в отличие от штамма-донора, не обладали несвойственной и ненужной для Rhlzobium способностью индуцировать бородатые корни.

Пример 2. В микровегетационном опыте по той же методике была исследована динамика нодуляции корней люцерны после инокуляции 4 из полученных рекомби- нантов. Каждым рекомбинантом, а также - в качестве контроля - штаммом-реципиентом инокулировали по 30 проростков. Отмечалось среднее количество клубеньков на 1 растение на 9-й, 10-й, 15-й, 22-й и 30-й дни.

Результаты представлены на фиг.1.

Как показано на чертеже, отобранные штаммы превосходят исходный родительский штамм по скорости образования клубеньков на люцерне.

Известно, чтоу мутантов Rhizoblummelllotl с задержкой нодуляции отмечается снижение

конкурентоспособности, соответственно ускоренная нодуляция будет коррелировать с усиленной конкурентоспособностью. Для анализа конкурентоспособности исследуемых штаммов был поставлен микровегетационный опыт,

0 в котором использовали метод относительной оценки конкурентоспособности по массе растений по методике, изложенной в статье ЛАШарыповой и Б.В.Симарова Метод сравнения конкурентоспособности эффективных

5 штаммов Rhizobiummeliloti-Труды ВНИИс/х микробиологии, т.55,1985, с. 85-90. Совместно с исследуемым штаммом была проведена инокуляция неактивным штаммом CXMI-48, обладающим высокой конкурентоспособно0 стью, в концентрации, в 1000 раз превышающей концентрацию исследуемых рекомбинантов. Конкурентоспособность учитывали как отношение прибавки массы растений, полученной при совместной ино5 куляции, к прибавке массы растений, полученной в варианте моноинокуляции активным штаммом. Использование больших пробирок позволило выращивать растения в течение 2 мес. Результаты опыта

0 приведены в табл.2.

Как показывает табл.2, по своей симби- отической эффективности исследуемые штаммы на 20-40% превзошли исходный штамм СХМ1-105. Конкурентность рекомби5 нантов в 2-3 раза превосходила конкурентоспособность штамма CXMI-105. Для окончательной оценки конкурентоспособности полученных рекомбинантов был поставлен вегетационный опыт на

0 нестерильном песке в 3-килограммовых сосудах в пятикратной повторности. В качестве инфекционной нагрузки был также использован штамм СХМ1-48 в соотношении 1000:1. Результаты опыта приведены в

5 табл.3.

Как показывает табл.3, отобранные ре- комбинанты обладают не только высокой симбиотической эффективностью и азотфиксирующей активностью, но также спо0 собны успешно конкурировать с местной популяцией клубеньковых бактерий за сайты взаимодействия на корнях люцерны. Кроме того, в той же таблице 3 показаны результаты анализа абсолютной конкурен5 тоспособности этих штаммов по маркеру устойчивости к канамицину. Для этого из клубеньков, образованных на корнях люцерны, выделяли штаммы бактерий и высевали их на селективную среду с канамицином. Было проверено по 100 клубеньков. Результаты показывают, что метка сохраняется, и отобранные штаммы действительно высококонкурентоспособны. Стабильность сохранения плазмид в клетках R.melllotl проверяли в течение 1,5 лет методом электрофореза в агаровом геле. Отобранные рекомбинанты были стабильны.

Таким образом, можно заключить, что предлагаемым нами способом можно на основе селекционных штаммов быстро получать штаммы с высокой азотфиксирующей активностью и симбиотической эффективностью за счет повышения их конкурентоспособности, повышения количества клубеньков, образованных этими штаммами.

0

Формула изобретения Способ получения штамма клубеньковых бактерий люцерны, включающий введение в их геном дополнительных плазмид, отличающийся тем, что, с целью повышения азотфиксирующей активности и симбиотической эффективности штаммов за счет повышения количества образованных клубеньков, введение в геном дополнительных плазмид проводят путем триродительского скрещивания штамма клубеньковых бактерий люцерны, штамма бактерий Agrobacterlum rhlzogenes Д32 15834, содержащего плазмиду pPON, штамма бактерий Escherichla coli СбОО, несущего плазмиду RP4-4. и отбирают клоны, обладающие повышенной азотфиксирующей активностью и симбиотической эффективностью.

Использование: в области сельскохозяйственной микробиологии, для получения штаммов клубеньковых бактерий люцерны с повышенной конкурентоспособностью. Сущность изобретения состоит во введении в геном бактерий дополнительной плазмиды pPON, промаркированной транспозоном Tn5-mob, с помощью триродительского скрещивания штамма клубеньковых бактерий люцерны штамма Agrobacterlum rhizogenes Д 32 15834, и штамма бактерий Escherichla coll С600, несущего плазмиду RP4-4, и последующего отбора клонов с высокой азотфиксирую- щей активностью и симбиотической эффективностью. 3 табл.1 ил.

Свойства рекомбинантов СХМ1-105 (pPON)

Т а б л и ц а 1

9182288310

Таблица2 Симбиотические свойства рекомбинантов в условиях микровегетационного опыта

Та бл и ц а 3 Симбиотические свойства рекомбинантов в условиях вегетационного опыта

У

о

2

о

5

Лл1

Ал,1

лД

ОЛА

ПcxMi

22

ЛЧИ

-t-

30