Способ подготовки мозговой ткани к исследованию секреции медиаторов Советский патент 1986 года по МПК G01N33/48 

к to

ел

Изобретение относится к медицине, в частности к способам исследования нервной системы, преиму0:ественно процессов секреции биологически активных соединений,

Цель изобретения - ускорение и повьппение физиологичности способа за счет устранения приемов подготовки, травмирующих ткань, инкубацию и отмывание проводят при рН 7,20-7,35, причем отмывание осуществляют путем 10-15-кратного переноса в свежую среду инкубации.

На фиг,I показана функциональная схема устройства; на фиг,2 - схема держателей срезов; на фиг, 3 - блок термостатирования; на фиг,4 - делитель карбогена.

Функциональная схема содержит водяные термостаты 1 для исследуемых образцов ткани и основных инкубационных сред, держатели 3 срезов, подключенные силиконовыми трубками 3, к выходам делителя 4 карбогена, объемы 5а и 56 основных инкубационных сред, подключенные силиконовыми трубками 6 к выходу делителя карбогена, автоматические дозаторы 7а и 76 подключенные силиконовыми трубками 8 к объемам основных инкубационных сред, и источник 9 карбогена, подключенный силиконовой трубкой 10 к делителю карбогена. Трубки, подающие карбоген (фиг,1), представлены сдвоенньии тонкими линиями, а инкубационные средыодинарной жирной,

Держатели срезов мозга (фиг.2) предназначены для быстрого переноса образцов исследуемой ткани из одной инкубационной среды в другую.

При помощи алмазной пилки в нижней части полой стеклянной трубки диаметром 10 мм и длиной 70 мм выпиливают под струей воды два окна шириной 4-5 мм и длиной 7-8 мм для циркуляции среды 11 инкубации. На 3-4 мм выше окон вьшиливают четыре отверстия 12 диаметром 1-2 мм для циркуляции карбогена. На верхней части стеклянной трубки выпиливают отверстие 13 для выхода излишка карбогена. Окна покрывают нейлоновой сеткой 14 одноразового пользования, которую прикрепляют к корпусу держателя силиконовым кольцом 15, Силиконовые трубки от делителя 16 карбогена фиксируют в держателе при помощи резиновой пробки 17 на такой высоте, чтобы они не

погружались в инкубационную среду при переносе туда держателя. Так как среда предварительно насыщена карбогеном, то карбоген, поступающий в держатель 2 через четыре отверстия в корпусе, полностью вытесняет воздух с поверхности среды инкубации и препятствует обмену карбогена, растворенного в среде с воздухом. Такое поддержание насыщенности среды позволяет использовать одновременно несколько держателей. Полный блок держателей образцов (фиг,2) состоит из подвесного штатива-встряхивателя 18,

5 имеющего восемь гнезд диаметром 20 мм и одно гнездо диаметром 50 мм для общего объема, в котором одновременно инкубируют четыре образца ткани, заключенные в держатели, а также из ,

0 пробирок 19 диаметром 15-20 мм и высотой 40 им для инкубации сред, в которые помещают держатели 20 образцов,

Блок термостатирования (фиг.З), предназначенный для термостатирова5ния образцов ткани, инкубационных сред, состоит из двух термостатов в для гемокоагуляции - ТПС, В середине ванны 21 первого термостата подвеской 22 прикрепляют свободно качающий0ся гататив-встряхиватель 23 длиной 155 мм, шириной 55 мм и высотой . 40 мм. Подвеску 22 прикрепляют нижним концом к нижней пластине штатива 23, При этом длина подвески составляет 80 мм. Справа, на корпусе термостата,

5 прикрепляют мотор 21 с шатуном 25 для встряхивания штатива. Мотор прикрепляют к корпусу термостатакронштейном 26, к которому и крепят при по40мощи длинного болта и гаек подвеску 22, Вторую подвеску штатива с противоположной стороны прикрепляют к корпусу ванны также при помощи кронштейна, болта и гаек. Блок содержит

45 также-контактный 27 и измерительный 28 термометры и мотор 29 для перемешивания жидкости в-ванне.

Автоматическую подачу инкубационш 1Х сред осуществляют двумя автома50тическими дозаторами 7а и 76, которые предназначены для подачи инкубационных сред фиксированными объемами в инкубационные пробирки 19,

. Делитель карбогена (фиг,4) пред55назначен для равномерного распределения карбогена во все Необходимые узлы и блоки. Он состоит из сосуда 30, наполненного водой для увлажне3ния карбогена, тройника 31, первый выход которого связан с объемом 5а инкубационной среды, третий выход с объемом 56 среды деполяризации, метверника 32, вход которого связан с вторым выходом тройника 31, а каж дый из четырех выходов связан с соответствующим держателем образцов ткани. Стрелками указано направлени движения карбогена. Все узлы делителя соединяются между собой силико новыми трубками. Способ осуществляют следующим об разом (отдельные приемы осуществления обозначены буквами А, Б, В,., и т.д,) Образцы ткани, заключенные в держатели, вносят в один стакан, помещенный на штативе термостата и содер жит среду инкубации, и инкубируют при 37 С. Все остальные приемы прово дят при той же температуре. При использовании меченых биологически активных соединений инкубацию проводят в присутствии данного соединения. Промывка, А, За 1 мин до окончания времени совместной инкубации образцов ткани в тот же штатив помещают пробирки (9, фиг,2), которые заполняют 2 мл среды инкубации (объем 5а) автоматическим дозатором 7а. Б, По истечении времени совмест1ной инкубации держатели помещают каж дый в отдельную пробирку и инкубируют 2 мин, В, Приемы, описанные в А и Б, пов торяют 10-15 раз. Использованную инкубационную среду выливают. Секреция, Г, За 1 мин до окончания промьшки новую серию пробирок за полняют 1 мл среды инкубации куда переносят держатели после промывки и инкубируют 2 мин. После этого приема инкубационную среду сохраняют дляко личественного исследования - спонтан ная секреция, Д, За 1 мин до окончания спонтанной секреции новую серию пробирок заполняют 1 мл среды деполя ризации (объем 56) автоматическим до затором 76 и переносят туда держатели, инкубируют 2 мин. После этого приема среду также сохраняют для количественного ислледования - вызванная секреция. Фармакологический анализ. Для исследования влияния фармакологических агентов на секрецию биологически активных соединений приемы А и Б пов50, 4 торяют 5-8 раз (10-16 мин). Дальнейшие приемы промывки (10-14 мин) выполняют ПРИ добавлении в инкубационную среду определенной концентрации фармакологического агента. Приемы Г и Д вьтолняют также при наличии в средах той же концентрации агента. Возможность практического применения изобретения для исследования секреции и влияние фармакологических агентов на секрецию биологически активных соединений подтверждается следующими примерами. Пример 1, Для инкубации срезов используют среду № 1; содержащую, мМ: NaCl 118; КС1 4,8; CaCl2l,3; MgSO; l,2; глюкоза 11,1; ЭЛТА 0,004; аскорбиновая кислота 0,1, а фосфатный буфер рН 7,25 - 1; NaHCO - 15; рН 7,25 при насьппении карбогеном (95% 0,2 + 5% СО), Для деполяризации срезов используют среду № 2, отличающуюся от среды № 1 только содержанием NaCl 109,8 мМ КС1 20 мМ, Четыре тангенциальных среза коры мозга крыс, толщиной 0,3 мм помещают в четыре держателя, свободно пронумерованных, при этом номер среза соответствует номеру держателя, и инкубируют 10-15 мин в общем объеме, содержащем 4 мл среды № 1, при 37°С, Затем в общий объем добавляют 1020 мкКи DL-H -норадреналина НА, Amersham, Англия, удельная радиоактивность 10-20 Ки/мМ с конечной концентрацией 2,5x10 М на 1 мл и инкубируют 10 мин. Первый этап. После инкубирования каждый держатель со срезом отдельно, но параллельно, промывают 30 мин в среде № 1 , Промывка описана вьпие (приемы А, Б, В), Затем проводят приемы спонтанной и вызванной секреций (Г,Д) с использованием сред № 1 и 2, Второй этап. После исследования секреции срезы промывают восемь раз 2 мл среды № 1 по 2 мин инкубации. Затем срезы I и III промывают 7 раз1 мл среды Н 1 по 2 мин инкубации. резы II и IV промывают параллельно I и III при тех же условиях, но в реду инкубации автоматической микроипеткой добавляют 0,05 мл немеченоо НА с конечной концентраций 10 М а 14 мин до спонтанной секреции. понтанную и вызванную секреции проодят также при концентрации НА 10 °М, Третий, четвертый и пятый этапы полностью повторяют второй с той лишь разницей, что в зтих этапах л - 1 г 8 I г применяют 10/, 10 М немече ного НА соответственно. Для исследования радиоактивности из проб отбирают по 0,2 мл среды и добавляют в сцинтилляпионный флакон, содержащий 10 мл сцинтиллятора Брея. Радиоактивность пересчитывают в счетчике фирмы L КБ, Rak Betta и выражают в распадах в минуту. Определяют интенсивность секреции Н - НА S . - вызванная секреция срезов I спонтанная секреция. Для 2,17; и III соответственно S 1.87; 1,53; S,j 1,59; 2,18; S 1,43; 1,99; S - 2,06; 1 7 J , / J , , 1,62; SCP 1,74+0,2; коэффициент ва риации CV 13,7% (1-5 - номера этапов). При фармакологическом воздействии экзогенного НА (концентрации ука заны в скобках) для срезов II и IV соответственно S, 1,85; 2,05; S ( М) 1,88; 1,99; Sg() 2,53; 2,09; S () 1,51; 1,79 Sg (10 М) 1,21; 1,26. Степень изменения интенсивности секреции в п- М этапе по отношению к первому S . .Для срезов I и III соответственно S, 0,73; 1,42 0,86; 1J3; sj 0,67; 1,3; S 0,95; 1,06, При фармакологичес 2 0« кнх поздействиях экзогенного НА, S, (НА) S,n(KA)/S, для срезов I и IV соответственно S (10 М) 1,02; 0,9 ; Sj (10 М) ,37; 1,02; S (108 М) 0,82; 0,87; S (1ом) 0,65; 0,61. Определяют степень фармакологического влияния исследованных концентраций экзогенного НА на интенсивность секреции Н - НА. ,, /.1 - (-,). /(С. щ1}/2; С(10° М) 1,02/0,73 + 0,97/1,43/2 1,04; С(10 М) 1,37/0,86 + +1,02/1,13/2 1,25; С() 0.82/0,67 + 0,87/1,3/2 0,92; 0() 0,65/0,95 + 0,61/1,06/2 « 0,63. Пример 2. Для определения высокоаффинного захвата НА вычисляют процентное отношение последующего спонтанного выделения Н НА СВ, где п 2-5 к СВ (1-5 - номера этапов), и влияние экзогенного НА на этиотношения. Табл,1 иллюстрирует влияние экзогенного НА на спонтанное выделение Н - НА из срезов коры мозга крыс в инкубационную среду. Таблица

Изобретение относится к медицине, в частности к способам исследования нервной системы, преимущественно процессов секреции биологически активных соединений. Цель изобретения - ускорение и повышение физиологичности способа путем исключения приемов подготовки, травмирующих ткань. Инкубацию и промывку срезов проводят способом перфузии при рН 7,20-7,35. Отмывание осуществляют путем 10-15-кратного переноса в свежую среду инкубации, содержащую NaCl, КС1, CaClj, MgSO., глюкозу, аскорбиновую кислоту, NaKCOj при насыщении карбогеном. Инкубационную среду сохрйняют для количественного исследования - спонтанная секреция. 4 ил, 2 табл.

Для построения кинетической кривой зависимости от концентрации захвата НА .вычисляют чистый эффект воздействия экзогенного НА двумя способами. Первым способом пересчитьгоают величину отношения II/I. Чистый эффект соответствует концентрации НА составляет 10 М 1,2 - 1 0,2; 10 М 2,24 - 1 I ,24. Вторым способом приравнивают отношение 1 к 50% и пересчитывают чистый эффект соответствующей концентрации НА для

(50/2,28) X

10

10,1 X 10

М

(50/48,8) X 104,8 - 50 58,3. Используя систему.двойных обратных координат, получают линейный график высокоаффинного захвата НА с Км 1,5 к .

П р и М -е р 3, Для сравнения некоторых параметров было поставлено три опыта, в которых промывку срезов проводили способом перфузии.

Табл.2 иллюстрирует результаты осуществления предложенного способа при различных условиях в сравнении с известным. Предла7,25 223,Иг73,4 1,9 гаемый IО 7,31080,81:59,4 2,15 7,35 980,21572,37 Извест7,4 2323 4272,4 ный

Формула изобретения

Способ подготовки мозговой ткани к исследованию секреции медиаторов путем приготовления срезов ткани, инку бации в среде насыщенной карбогеном и отмывания с последующей регистрат ией уровня в среде, о т л иТаблица 2

чающийся тем, что, с целью ускорения и повьппения физиологичности способа за счет устранения приемов подготовки, травмирующих ткань, инкубацию и отмывание проводят при рН 7,20 - 7,35, причем отмывание осуществляют путем 10-15-кратного переноса в свежую среду инкубации. 1ч 30 мин 8 4 2ч 10 мин 8 4 2 ч 30 мин 8 4 От 3 ч 20 мин I до 4 ч 10 мин

IZ- 11

I Л

23

2J /

cxJd

гв

2ff

Ы-И

И

Л

I-E:

iZ

/rZJ

...4