Способ выявления сиаловых кислот в гистологических средах Советский патент 1993 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к гистологии, цитологии, эмбриологии, патоморфологии. и может быть использовано для избирательного выявления сиаловых кислот в срезах тканей и органов.

Цель изобретения - повышение селективности выявления сиаловых кислот.

Существенным отличием предлагаемого способа является то, что для избирательного выявления остатков сиаловых кислот в составе молекул гликополимеров проводится предварительное блокирование свободных терминальных остатков D-галактозы и М-ацётил-О-галактозамина нативными лектинами арахиса и сои, а затем выявляются остатки сиаловых кислот с помощью лекти- на бузины черной, коньюгированного с пероксидазой хрена.

Способ осуществляется следующим образом. Из фиксированной в 10% нейтральном формалине и заключенной в парафин

ткани готовят срезы толщиной 5-7 мкм. После депарафинации активность эндогенной пероксидазы ингибируют при инкубации срезов в метаноле, содержащем 0,3% Н202, и через спирты нисходящей концентрации доводят до забуференного физиологического раствора (ЗФР). Обрабатывать лектином можно и криостатные срезы, которые готовят конвенциональными методами. С целью блокирования субтерминальных остатков D-галактозы и М-ацетил-О-галактозамина перед обработкой срезов меченым лектином бузины черной проводится их инкубация в растворах нативных лектинов (не. коньюгированных с пероксидазой) арахиса и сои в течение 30 мин при концентрации лектина в инкубационной среде 50 мкг/мл. После отмывания избытка лектинов арахиса и сои в двух порциях ЗФР срезы обрабатывают конъюгатом лектина бузины черной с пероксидазой, активность пероксидазы проявляют с помощью диаминобензидина в

00

о

00

00

о

присутствии 0,0015% H2U2. Избыток преципитата хромогена удаляют в двух порциях Н20, препараты заключают в сироп Апати либо, после дегидратации, в нейтральный канадский бальзам.

П р и м е р. Из фиксированной в 10% нейтральном формалине и заключенной в парафин поднижнечелюстной слюнной железы овцы готовят срезы толщиной 7 мкм, помещают их в каплю дистиллированной воды на обезжиренное предметное стекло и высушивают в термостате при 42°С в течение 24-72 часа. Затем срезы депарафиниру- ют, инкубируют 30 мин в метаноле, содержащем 0,3% H2U2 и через спирты нисходящей концентрации доводят до ЗФР (состав ЗФР: 1 л Н20. 8,0 г NCI, 1 f NaHPO/j, 0,2 г KCI рН доводят до 7,5 с помощью 1 н HCI). После этого срезы инкубируют 30 мин в растворах нативных лектинов сои и арахиса (не конъюгированных с пероксидазой). Избыток лектинов арахиса и сои удаляют путем двухкратного промывания срезов в ЗФР. Затем 45 мин срезы инкубируют в ЗФР, содержащем 100 мкг/мл лектина бузины черной, меченого пероксидазой, и отмывают в двух порциях ЗФР. Визуализацию рецепторов лектина бузины черной осуществляют путем инкубации срезов в ЗФР, содержащем 0,05 диаминобензидина тетра- гидрохлорида и 0,15% Н202 в течение 3 мин. Активность пероксидазы, связанной посредством молекулы лектина с остатками сиало- вых кислот гликоконьюгатов, выявляют по коричневым отложениям преципитата окисленного диаминобензидина. После удаления избытка хромогена в двух порциях НаО препараты заключают в нейтральный канадский бальзам. В местах локализации сиалогликанов после проявления описанной гистохи- мической реакции появляется насыщенная коричневая окраска. В местах, лишенных сиалогликанов, окрашивание отсутствует.

В таблице представлены результаты сравнения эффективности различных способов выявления сиалогликанов в поднижнечелюстной железе овцы.

Из таблицы видно, что при обработке гистологических препаратов поднижнечелюстной слюнной железы овцы 1 % раствором альцианового синего при рН 2,5 очень значительно окрашиваются мукоциты, умеренно выраженную реакцию дают сероциты, кроме того окрашиваются и другие структурные элементы железы (коллагено- вые и эластические волокна, десмоциты). При проведении метилирования при 37°С с последующей окраской препаратов альциановым синим очень интенсивно окрашиваются мукоциты, умеренно выраженную или слабо положительную реакцию дают серо- циты и другие структурные компоненты железы. Обработка гистологических срезов

пектином бузины черной, конъюгирован- ным с пероксидазой дает интенсивную реакцию со стороны мукоцитов, кроме того умеренно окрашиваются сероциты и другие структурные компоненты железы. Обработка препаратов нативными лектинами арахиса и сои, связывающими терминальные остатка D-галактозы и М-ацетил-О-галакто- замина, с последующей окраской лектином бузины черной, коньюгированным с пероксидазой, содержащих значительное количество сиаловых кислот, дает интенсивную реакцию со стороны мукоцитовг что и обеспечивает повышение селективности, остальные структурные компоненты железы

ареактивны.

Предлагаемый способ обладает большей селективностью по сравнению с известными, более удобен в техническом исполнении, позволяет дифференцировать

сиалогликаны от других кислых гликопроте- инов.

Ф р р м у л а и з о б р е т е н и я Способ выявления сиаловых кислот в

гистологических срезах, включающий обработку срезов лектином бузины черной, коньюгированным с пероксидазой хрена, отличающийся тем, что, с целью повышения селективности способа, перед обработкой

срезов лектином бузины черной их инкубируют в смеси нативных лектинов арахиса и сои, а сиаловые кислоты выявляют по коричневому окрашиванию после обработки диаминобензидина тетрагидрохлоридом.

Область использования: биология и медицина, а именно гистология, цитология, эмбриология, патоморфология, Сущность изобретения: проводят предварительное связывание терминальных остатков галактозы и М-ацетил-О-галактозамина путем инкубации срезов с нативными лектинами арахиса и сои, затем обрабатывают срезы лектином бузины черной, конъюгированным с пероксидазой хрена, а затем выявляют активность пероксидазы в системе диамино- бензидин-Н2 02 и идентифицируют место локализации сиаловых кислот по наличию коричневоокрашенного продукта реакции.