Способ выращивания микроорганизмов Советский патент 1979 года по МПК C12B1/08 

(54) СПОСОБ ВЫРАЩИВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ непрерывного процесса высоко эфф тивна. Содержание пены в фермент можно описатькак .дисперсию газо разной фазы в жидкой фазе, как э гированную газообразную фазу или йто. как эмульсию газовой или жи фазы, где увеличенная поверхност между газовой и жидкой фазами ус вает процесс фермента хии, Способ осуществляют следующим разом. Процесс ферментации проводят тательной среде, содержгидей алиф ческие спирты с прямой цепочкой ющие от 1 до 16 атсмов углерода молекулу, которые обеспечивают у род и энергию для роста микроорг мов. Спирт имеет от 1 до б атомо ;лерода на молекулу, предпочтител использовать этанол или метанол лее предпочтительно - метанол. В качестве спиртов используют танол, этанол, 1-пропанол, 1-бут .1-октанол, 1-додеканол, 1-гёксад нол, 2-пропанол, 2-бутанол и 2-г :нол. При необходимости можно так использовать смеси этих спиртов В процессе ферментации микроо низмы, способны усваивать один ил .лее указаннь&с спиртов в качеств :точника углерода и энергии при и росте или развитии. Соответствующие микроорганизм можно выбрать из бактерий, дрожж и грибков. Можно использовать др видов Candida, HansenuEa, Toruto Saccaharomyces, Pichia,- Debaryom ILiporayces, Cryptococcus, Nematos и Brettahomyces.; Предпочтительнее использовать жи разновидностей Ca.ndida, Hainse Torutopsis, Pichia ,и Saccharomuc r - , Кроме того, используются виды жёй; Candida boidinii Candida mycoderma Candida utiEis Candida stetCatoidea Candida r:obusta Candida сCaussenii Candida rugosa Brebtanomyces petrophiEiimi НапфепиЬа minuta HanSenuEa saturnus Hansenuta caCifornica JHaiisenuta jnrakii siTvico&a Hanienula po&ymorpha Hansenuta Hansenuta wickerhaitiii capsuKata HansenuEa gEucozyma HansenuEa henricii Hansenuea Hansenuta nonfermentans phiCodendrei Hansenuta oruCopsis Candida bobmii orutopsis orutopsis yersatiEis orufcopsls gtabrata oruCopsis moEishiana nemod.endra orutopsis oruEopsis nitratophitta oru&opsis ichia farinosa ichia potymorpha ichia membranaefaciens ichia pihus ichia pastoris ichia trehaCophibia cerevisiae , Saccharomyces fragitis S a cc ha r oitiy ce s Saccharomyces acidifaciens Saccharomyces eEegans Saccharomyces Saccharomyces rouxii eactis Saccharomyces fractum . Saccharomyces спользуются бактерии BHjciaBacieeus, obacterium,Actinomyces, Nocardia, udomonas Methanomonas, Protamino- ter, Methyiococcus, Brevibac teriiom,,, tobacter, Micrococcus, Rho aopseu d6-{ as, Corynebacterixom, Rhodopseudoa.s, Microbacterium, Achromobacter. hybobacter, Methytosihus и Methyystis. . Предпочтительнее использование терий разновидности BaciBtus, udomonas, Protaminobacter, Microcus, Arthrobacter и Corynebaetem, Используются виды бак терий: Bacittus subtiCus BaciR6us cereus Bacittus etureus Bacieeus acidi Bacieeus urici BaciCEus coagufcans BaciBfcus mycoides BacitCus circufcans Baci Wus megaterium Bacie&us ticheniformis .niethahoeica Pseudoraonas eigustri Pseudomonas orvi6&.a Pseudomonas Pseudomonas methanica ffcuprescens Pseudomonas Pseudomonas aeruginosa oCeovorans Pseudomonas P s eudomona s putida Pseudomonas boreopotis Pseudomonas pyocyanea methyCphitus Pseudomonas Pseudomonas brevis Pseudomonas acidovorans methano Box 1 ila n: Pseudomonas Pseudoirtonas aerogenes Protaminobacter ruber simptex Corynebacterium hydrocar Corynebacterlum a&kanuin Cprynebacterivun Corynebacteriiuti o&eophi hydrocar Corynebacterium gCutamic Corynebacterium Corynebacterivim viscosus dioxydan Corynebacterium a&kanum Corynebacterium Micrococcus cerificans Micrococcus rhodius. Arthrobacter rufescens Arthrobacter parafficum Arthrobacter simpEex Arthrobacter citreus Methanomonas methanica Methanomonas methanooxid Methyfcomonas agi&e MethyEomonas afcbus Methy6omonQ:s rubrum MethyComonas methanoBica Mycobacterium rhodochrou Mycobacterium phBei Mycobacteriun brevicate Nocardia saCmonicoEor Nocardia minimus Npcardia cora fcina Nocardia butanica Rhodopseudomonas capsuEa Miurobacterium ammoniaph Vrchromobacter coagubans Brevibacterium butanicum Brevibacterium ropeum Brevibacterixun fCavum , Brevibacterium Sactofer Brevibacterium paraffin Breviba.cterivim ketogEut Brevibacterium insectip Применяются урибки из род Cus, Moni&ia, Rhizopus, Pe Mucor, A ternaria и He6min Примера используемых вид Aspergi6e.us niger AspergiC6us geaucus, AspergiEBus ffavus Aspergieeus terreus AspergiKEus itconicus notatum Penicietium Peniciteium chrysogenum PeniciCEium g 6aucum griseofuEvum Penici&eium Penicibbium expansum digitatum Penici EEium itaEicum Penici Rhizopus nigricans Rhizopus oryzae Rhizopus detemar Rhizopus arrhizus Rhizopus stoBonifer Mucor mucedo Mucor genevensis. Ha рост микроорганизмов окаэывает влияние температура ферментера и каждый отдельный вид микроорганизма имеет оптимальную темпepaiTypy для роста. Выращивание в;ферментере проводят при 30 и , предпочтительно между 35 и . Температура зависит от используемых в процессе ферМента ции видов микроорганизмов, так как они будут некоторое различие в соотношении температура/скорость роста. - , .: Соответствзшщую питательную среду подают в ферментер для обеспечений ,питательных вацеств, таких как усва;иваемый источник азота, фосфора, магния, кальция, калия, серы и натрия, так же каК: следа меди, марганца, молибдена, цинка, желе1эа, бора, иода и |селена, при этом количество питатель|ных веществ йзмбншот в завйсимости ют выбранного для 1процесса вида микроорганизма. Питательная среда может такжё содержать.витамины, присутствие jKOTopHX желательно для развития оп ределенных видов микроорганизмов. Мно,гие из дрожжей требуют наличия одного ИЛИ двух витаминов, например биотин и тиамин. Со.став питательной среды на 1 л ВОДНОГО раствора; 2,0 МП (85%) 1,0 г 1,5 г MgSO;). THgO 0,2 г масе0,1 г Раствор неорганиГческих соединений. - 5,0 мл. Раствор неорганических соединений в виде следов имеет следующий состав, г/л:. Na5,MoO4 2Н О При использовании проведенной питательной среды источник усваиваемого азота обеспечивают раздельным добавлением водного раствора аммиакё1 (NH4.OH) в ферментер. Количество добавки NH4OH зависит от рН требуемого для данной реакционной смеси, которое без добавления .ОН рН равно, примерно, 2 для питательной среды. При использовании .в процессах ферментации дрожжей или грибков рН равно, пример7060268

о, 3-5, а при иСП ешьзоваНИИ бактеий рН равно 6-7,5.

Ферментация представляет собой эробный процесс, в котором кислород, необходимый для процесса, получают з источника, содержащего кислород, 5 апример из воздуха, который подают емкость для ферментации при давлении, приблизительно от 1 до 100 атм. и, предпочтительно, от 1 до 10 атм. Хорошим йсточниксрм кислоройа являет- д ся воздух,. обогащенный кислороде. На реакцию ферментации часто благоприятно действует применение давления в в й11ёуказ4нной области и в предпотительных пределах. .с

Ферментацию проводят непрерывно или пер иодически. В непрерывном или периодическом процессе ферментер вначале стерилизуют, а затем его засева1отку;льтурой микроорганизма при наличии всех необходимых питательных ве- щёств, включая кислород и источник угл грода. При непрерывном процессе йстсзчнйк кислорода или воздух подают непре1рывновместе с непрерйвным вводом питательной среды, источника азо- 25 та (если он добавляется отдельно) и спирта с расходе, который илИ предварительно задают, или задают в соответствии с требованием регулирования таких параметров, как концентрация 30 спирта. Степень растворения кислород, концё нтрация кислорода или iflsyокиси углерода, в rji3ax,выходящихиз ферментера. Скорость поДачи различных веществ изменяют так, чтобы В5 при эффективнее использованииспирта получить как быстрый рост микроорганизмов, так и возможную консистенцию, т. е. высокий весовой выход микроорганизмов на вес загружаемого спирта. 40 Скорость подачи спирта является вгикной переменной величиной, подлежащей регулированию, так как высолая концёйтрация спирта может фактически затормозить рост 1У1икроорганизмЬв и дс даже убить микроорганизм, поэтому ее регулируют так, чтобы спирт микроорганизмы потребляли с той же скоростью, с какой спирт поступает в ферментер, Удовлетворительные условия достиггиот, . если в выходящем потоке будет содержатьс/1 около 0,5 об.% спирта. Для высокЪй продуктивности или скорости рост микроорганизмов концентрация спирта, поступающего к ферментеру, будет Составлять, примерно, от 7 до 30 об Л.

i Для периодического или непрерывного процесса концентрация вещества, идущего на переработку, например метанола, должна находиться между 60

0,001 и 5 об.% .и, предпочтительно, между 0,005 и 0,5 об.%. В другсяи слу:Чаё при периодическом процессе ферментации питание можно добавлять порциями и постепенно.

В процессе ферментации используют контрольно-измерительную аппаратуру для измерения плотности микроорганизмов, рН, концентрации растворенного кислорода и спирта на входе и выходе из ферментера, обеспечивая тем самым полную систему управления процессом.

Продукты, подаваемые в ферментер, обыЧнО стерилизуют дЛя предотвращения заражения смеси в ферментере нежеЛательньми жизнеспособными микроорганизмами. Удаляемый из ферментера поток надлежащим образом обрабатывают для сепарации микроорганизмор, содержащих белок, образуклцийся в одноклеточных Организмах, например, с помощью тепла и/или химических реагентов, например кислоты для умерщвления микррбиальных клеток и их отделения от водной, фазы посредством коагуляции или флоккуляции. После такой обработки смесь центрифугируют для удаления большей части жидкой фазы, и затем отделенные клетки сушат в барабанных или распылительных сушилках. Если в качестве культуры применяют дрожжи, вь1шеУказан 1ые стадии обработки могут быть /изменены : вначале про- . водят центрифугирование для сепарации клеток, которые затем умерщвляют под действием теплоты до или во вре-. Мя последующей, стадии сушки. После .сепарации и сушки клетки, содержащие .большое количество белка, готовы для использования в качестве источника питания для животных и/или людей.

Пример, Проводят три опыта, в качестве источника углер.ода и энергии используют метанол, который вводят в ферментер известного типа в условиях пенообразования. Объем ферментера составляет, примерно, 1500 л. В каждом опыте температуру поддерживают при и рЯ - 6,6. На выходе из ферментера отсутствует метанол, концентрация которого составляет 10 об,%. Питательной средой служит среда, описанная выше.. Используемые в каждом из этих опытов микроорганизмы представляют собой виды бактерий Paeudompnas methanica под номером NRRL В3449. Данные, представленные в табл. 1,получены после того, как каждый опыт достигает стадии готовности, примерно, через 12 час непрерывной работы. Процесс идет при 3-х различных давлениях«.

Таблица 1

Растворенн1Лй Oj в ферментере в пересчете на содержание Oj без присутствия клеток, %

Уровень 6i в выходящем воздухе, в пересчете на нормальный Оа, содержащийся в воздухе, %

Скорость подачи среды 1/час

Скорость подачи ,приблизительное значение Потребления NH4.0H (25 вес.% NHj), л/час

Вес сухих KirteroK, г/л

Обороты ме1аалки, мин Расчетные в.еличины Скорость разведения, час Время пребывания, час Норма аэрации об/об, мин Потребляекий Oj, кг/кг клето

Выход клеток, кг

CHjOH в пересчете на потребляемый метанол, кг

Нео 1ищенный белок (Ык-б25),%

Продуктивност-ь г. клеток, л/час

Результаты этих опытов показывают повышенную продуктивность непрерывной ферментации при наполнении ферментера пеной и массопереносе кислорода около 1000 Ог на л/час жидкой смеси.

(при давле- (при давлении на вхо- НИИ на входе в 2 атм) де в 2,75 атм)

55

15

48

40

67 270 235

2,3 4 30,6 24,6

(клетки, Летки,изоизоизолиро- лированные е ванные фильтрацией ей центрифу-пробы через ез гировани-фильтр МиЛем 10 м липор) пробы, промывка клеток, повторное центрифу-. гирование, сушка,

в3вешива- . ние)

940

1110

950

0,175

0,36

0,29 2,8 5,7 3,44 U,5 3,3 2,5 3,3 2,3 3,6

3,48

3,21

2,58 75 75 5

8,8

8,9

4,0

Контрольный пример.

Опыт, являющийся контрольным по непрерывной ферментации,также выполняют с использованием той же бактериальйой культ.уры, питательной среды и концентрации метанола, как в примере 1. Температуру поддерживают и рЯ - 6,3, близкие к величинам опытов примера 1. Этот опыт проводят в большей емкости обычного типа, снабженной лопастной мешалкой, так как ёмкость для ферментации работает при атмосферном давлении. Объем ферменти рующей смеси равен,примерно, 1125 л В выходящем из ферментера потоке метанол не обнаруживают. Полученный ве сухих клеток равен 19,1 г/л. Результаты подсчета для этого опы та ел бдуюоде. Норма разведения, час Время пребывания, час Выход,кг СН ОН/кг клеток Неочищенный белок, % Продуктивность, г/л/час : Результаты этого опыта хуже резуль татов опыта 1 в примере 1, где ИСПОЛ ЗУЮТ ферментер с пеной.

Скорость подачи NH ОН в пересчете, на содержание Ог без присутствия клеток, л/час

Вес сухих клеток, г/л Обороты мешалки в Минуту Расчетные величины Скорость разведения, час Время пребывания, Ч:ас Норма аэрации, об/об/мин, Потребляемый Oj, кг/кг клеток

клеток, кг

в пересчете на нормальный О,

содержащийся в воздухе, клеток

Неочищенный белок, приблизителное 3 начение потребления (25% по весу

Продуктивность, г/л/час

.

1 24.

26 980 000

0,14

0,12

7,2

8,4

2,8

2,1

3,4

3,04

3,29

54 3,6

54 2,9 Пример 2.В опытах 4,5 (см. табл. 2) по непрерывной ферментации с метанолом используют ферментер, наполненный пеной, применявшийся в примере 1, и ту же питательную среду, но с культурой дрозкжей. В этих опытах используют 10%-ную концентрацию метанола, на выходе из ферментера в потоке метанол не обнаруживают. Каждый опыт проводят при атмосферном давлении. . Во время проведения опыта 4 устанавливают, что ферментирующая смесь загрязнена филаментныйй грибками, по этому перед пройедением опыта 5 систему реактора стерилизуют. Данные опытов 4 и 5 представлены в табл. 2, которые рассматриваются как типичные для гфоцесса непрерывной ферментации метанола при указанных услови ЯХ.. :, ., .... - . - , /.. . ,: Та блица 2

Эти результаты демонстрируют использование дрожжей для непрерывйой ферментации метанола в ферментере, заполненном; пеной, для производства белка одноклеточными организмакот. .

Так как дрож«и обладают присущей им более низкой скоростью роста, чем бактерии, производительность, показанная в табл. 2, ниже производительности, полученной при использовании бактерий.

Белки одноклеточных организмов, полученные предлагаемым способом, приобретают особенно важное значение В последние годы таких источников большого количества -недорогостоявдих белков, годных для употребления животными и людьми, как рыбная мука и соевые бобы, не хватает в связи с ростом народонаселения, Kpcwe того, происходит уменьшение производства рыб ной муки, зависящего от улова айчрусов.

Получение белков одноклеточных . организмов (ЗСР) может облегчить ; ; проблему посредством обеспечения источника белка, который можно включить в пищу домашней птицы, свиней и рогатого скота, что обеспечивает белками людей. Микробиальные клетки,

полученные предлагаемым способом, являются подходящим источником белков и могут, таким образом, использоваться в качестве пищи, а также; применены в других областях, например, для производства белковых клее,вых составов.

Формула изобретения

Способ выращивания Микроорганиз0мов, преимущественно бактерий и дрожжей, в условиях аэрации кислородсодержащим газом питательной среды, содержащей пряМОцепЬчнне алифатические спирты с 1-16 атомами углерода в мО5лекуле в качес.тве источника углерода, источник, азота и необходилие минеральные соли, о т л, и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью интенсификации процесса, аэрирование среды осу0ществляют так, что в процессе ферментации питательную среду с микроорганизмами поддерживают в виде пены с циркуляцией ее в процессе ферментации.

5

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент США 3.677895, кл. С 12 Ь 13/06, опублик;- 1972.