Способ определения биомассы микроорганизмов в почве Советский патент 1988 года по МПК G01N33/48 

со 00

00 00

Изобретение относится к почвоведению, сельскому и коммунальному хозяйству и может быть использовано для количественной оценки микробной биомассы при характеристике плодородия почв, а также при проведении санитарного контроля за состоянием природных объектов.

Целью изобретения является повы- шение точности способа определения.

На чертеже приведена кривая динамики образования растворимых органических соединений в в серой лесной почве.

I Способ заключается в том, что в I качестве биодидной обработки почвы I использук)т ее высушивание при 65- I70 С в течение 12-24 ч, содержание :клеточных компонентов определяют i сразу после заверш(гния биоцидной. об- : работки в солевой (0,5 N K,S04.) вытяжке из почвы, коэф(11ициент пересчета К находят в инкубационном эксперименте с внесением в данную почву известного количества ассимилируемого элемента по уравнению материального баланса, а расчет производят по формулам

х(е-е)/К, К(е -е -е+е,)/(Е-е ,- -(Р-РК),

где X - биомасса микроорганизмов в

мкг углерода/г почвы; е и е- содержание углерода в соле

.. 35

вой вытяжкб; из. почвы соответственно до (контроль) и после высушивания-регидратации, мкг углерода/г почвы; содержание углерода в этой же вытяжке из проинкубированной почвы соответственно до и после высушивания-регидратации, мкг углерода/г почвы;Е - исходное количество вносимой

в почву глюкозы, мкг/г ПОЧЕ1Ы;

Р - количество углерода в составе внеклеточных продуктов обмена

почвенных микроорганизмов,

мкг/г почвы.

Высушивание при умеренно высоких: температурах избирательно действует на живые микроорганизмы, нарушает барьер проницаемости клеток вследст- вис денатурации цитоплазматических мембран, при этом мертвое органическое вещество не разрушается. В ходе

5

0 5

5

0

5

0

5

последующей регидратации (встряхивание высушенной почвы с разбавленным солевым раствором) внутриклеточное содержрмое микроорганизмов переходит в жидкую фазу и может быть определено с помощью стандартных аналитических методов. Режим высушивания был избран исходя из того, что при 70°С не происходит сколько-нибудь заметного разрушения мертвого органического вещества, но в то же время клетки микроорганизмов эффективно обезвоживаются. Как видно из чертежа.через 12 ч высушивания достигается максимум выхода анализируемых соединений. Дальнейшее увеличение срока высушивания до 24 ч нескольких суток не сопровождается заметным увеличением солюбили- зации микробной биомассы. Высушива- ние-регидратация приводит к солюбили- зации не всех, а только части клеточных компонентов. Доля переходящих в раствор клеточных компонентов как раз и есть по своему физическому смыслу пересчетный коэффициент К. Величина К варьирует в достаточно широких пределах у различных микроорганизмов и даже у одного и того же микроорганизма в зависимости от его физиологического состояния. Поэтому разные почвы, различающиеся по составу микробного сообщества, характеризуются и разным численным значением К. Для прямого нахождения К необходимо вносить в образец почвы известное количество легкодоступного субстрата, содержащего ассимилируемый элемент (С, N, Р, К и т.д.), и затем инкубировать почву в благоприятных для роста микроорганизмЪв условиях температуры и влажности. Элемент внесенного в почву субстрата ли- бо остается непотребленным, либо утилизируется микроорганизмами,, включаясь в состав микробной биомассы и внеклеточных метаболитов. Их количества связаны между собой уравнением материального баланса. В качестве примера приводим уравнение материального баланса по углероду для случая внесения в почву глюкозы

C.so С-Х+ С С.р,

где - углерод, вносимый в почву

глюкозы;

- углерод остаточного количества глюкозы (при химичесC-v

-p

ee

31388802

ком анализе водной или солевой вытяжки из почвы в эту фракцию часто попадают также продукты брожения или неполного окисления глюкозы) ;

углерод, выросший на глюкозе микробньк клеток; - углерод внеклеточных продуктов обмена, главным образом СО . перечисленные величины могут

10

ты хл ро во пр дн и де

по

во ме

быть легко измерены, что позволяет

тывают парами хлороформа в течение 24 ч в эксикаторе. После этого пары хлороформа удаляют 3-кратным вакууми- рованием эксикатора, флаконы с почвой герметично закрывают резиновыми пробками и инкубируют в течение 10 дней при , Затем в обработанном и в контрольном образцах почвы определяют количество выделившегося СО,

по концен-трации СО в газовой

фазе.

Концентрацию СО определяют на газо-- вом хроматографе ЛХМ-8 МД с катаро- метром в качестве детектора. Резуль

Изобретение относится к почвоведению, эхологии, сельскому и коммунальному хозяйству. Цель изобретения - повышение точности определения. Способ заключается в высушивании почвы при 65-70 с в течение 12-24 ч, приготовлении солевой вытяжки (0,5 N K.S04) из высушенной почвы, измерении в ней содержания клеточных компонентов и последующем расчете содержания биомассы микроорганизмов в почве по формуле. Пересчетный коэффициент от содержания клеточных компонентов в солевой вытяжке к биомассе находят в инкубационном эксперименте внесением в данную почву известного количества ассимилируемого вещества. 1 ил., 2 табл. i (Л

найти количество углерода новообразо--с таты-определения: 120 мкг С-СО в

ванной биомассы по разнице: С

опыте, 74 мкг в контроле, р ность составляет 46 мкгС/г почвы. Принимая коэффициент пересчета ра ным 0,41 получают количество микр ной биомассы 112,2 мкгС/г почвы.

-5о -s

G.

Р

В результате роста микроорганизмов на глюкозе увеличивается и количество органических веществ, переходящих в солевую вытяжку после высушивания-ре гидратации.

Если обозначить прирост количеств С в солевой вытяжке из почвы по сравнению с контролем в момент внесения субстрата Л С, то величину К можно найти по формула

К - ,

-So -5t p-t

где С - прирост количества С в со левой вытяжке через t суток;

С.д и С.р - количество углерода в составе соответственно остаточного субстрата и СО. в момент времени t. Аналогичным образом можно найти величины К для других элементов, например N. В этом случае соединение азота необходимо вносить вместе с источником С и энергии, для того чтобы вызвать ощутимый прирост биомассы микроорганизмов.

Вместе с тем необходимо учитьшать и то, что в инкубационном экспери- менте нежелательно очень большое увеличение биомассы, так как это существенно искажает состав исходного микробного сообщества. Нет необходи

мости устанавливать величину К в каждом определении, для данной почвы это достаточно проделать однократно. П р и м е р 1. Определение количества микроорганизмов в почве фуми- гационным методом. 50 г серной лесной почвы (влажность 19,1%, свеже- отобранные образцы) просеивают через сито с отверстиями 3 мм, помещают во флакон емкостью 500 мл и обраба

опыте, 74 мкг в контроле, разность составляет 46 мкгС/г почвы. Принимая коэффициент пересчета равным 0,41 получают количество микробной биомассы 112,2 мкгС/г почвы.

Пример 2. Определение биомассы микроорганизмов методом регид- ратации. 50 г свежей серой лесной

5

0

О

5

5

0

5

почвы.

предварительно 3

просеянной через сито с ячейками 3 мм, помещают в конические колбы емкостью 300 мл и высушивают в сушильном шкафу при 70 С в течение 18ч. Одновременно контрольный образец (без прогрева) заливают 0,5 N раствором KjS04 (соотношение почва:вытяжка 1:2) и взбалтьтают на качалке 30 мин. Суспенз.ию фильтруют через крупнопористый фнльтр, вытяжку хранят до анализа в холодильнике при 4 С в течение 18ч. Из высушенной почвы готовят вытяжку аналогичным образом. Затем в вытяжке определяют количество органического углерода методом бихроматного окисления с использованием глюкозы В качестве стандарта. Результаты определения: 112,7 мкг С/г почвы в высушенном образце и 26,0 мкг С/г почвы в контроле. Увеличение содержания углерода, вызванное прогревом,,состав- ляет в данном примере 86,7 мкг С/г почвы.

Для определения коэффициента пересчета в почву вносят глюкозу в количестве 2 мг С/г почвы и инкубируют при 25 С при постоянной влажности 20 вес.% во флаконах, закрытых резиновыми пробками. Е момент внесения и на 1-4 сутки инкуба:, в почве определяют остаточное сод- .; Аание С в солевой вытяжке и измеряй количество COj в воздушной фазе флаконов. Парап- лельно определяют количество С в солевой вытяжке из почвы после высушивания.

В табл.1 представлены рез-ультаты определения.

Коэффициент пересчета К находят для каждого срока инкубации по фор- Йуле

К

e -eVieiex) (P-pJ

Среднее значение К оказалось рав- Ным 0,25, Биомассу микроорганизмов В почве X рассчитывают по формуле Х(е-е|) мкг С/г почвы.

П р и м е р 3. Определение С в со- певых вытяжках высушенной и контрольной почв производят по примеру 2. Цля нахождения коэффициента пересчета Навеску почвы 1 г помещают в пеницил- |1иновые флаконы и вносят 0,2 мл раст- Вора, содержащего 5 м:г С-глюкозы (исходная активность 80 mCi) г и ин- Кубируют при комнатной температуре. Через 1,6,28 и 72 ч определяют содер- в со тевой вытяжке до и по сjie высушивания. После этого определя- (от количество иммобилизованного С йутем бихроматного окисления.

В табл.2 представлены результаты определения.

Среднее численное значение К оказалось равным 0,27, Биомасса микроорганизмов в почве, рассчитанная по (|)ормуле примера 2, равна 321 мкг С/г почвы.

При мер 4. 50 г свежей серой лесной почвы помещают во флакон емкостью 500 мл, вносят глюкозу в количестве 2 мг С/г почвы и инкубируют )а течение суток при 25°С„ Затем определяют биомассу по примеру 1„ Результаты определения - 1530 мкг С-СО в опыте и 1810 мкг С-СО, в контроле, разность составляет отрицательную величину, т.е. фумигационный метод Непригоден для определения биомассы микроорганизмов в обогащенных почвах

П р и м е р 5. Почву инкубируют с глюкозой по примеру 4. Затем определяют биомассу микроорганизмов заяв- .ленным методом по примеру 2. Результат определения: 590 мкг С/г почвы в высушенном образце, 120 мкг С/г Почвы . в контрольном,. Биомасса микроорганизмов, вьфосших на глюкозе, рас- с.читанная по примеру 2, составляет 1850 мкг С/г.

П р и м е р 6. Берут свежие образцы кислой (рН водной вытяжки 4,5)

0

0

5

5

0

5

0

5

слабоокультуренной дерново-подзолистой почвы под кукурузой и проводят определение по примеру 2, Содержание микробной биомассы составило 71 мкг С/ /г почвы.

П р и м е р 7, Определение биомассы производят по примеру 2, но в другом режиме высушивания: при 65 С, время выдерживания образцов в сушильном шкафу 24 ч. Содержание микробной биомассы составило 328 мкг С/г почвы.

П р и м е р 8, Берут свежие образцы серой лесной почвы и проводят определение по примеру 2 за исключением того, что в солевых вытяжках вместо определения органического С измеряют содержание углеводов с фенолсернокис- лой смесью. Результаты определения: до высушивания содержание углеводов в солевой вытяжке 16 мкг С/г почвы, после высушивания - 32,4 мкг С/г почвы. Используя коэффициент пересчета, найденный в примере 2, получаем, что содержание углеводов микробной биомассы равно 66 мкг С/г почвы.

Пример 9. .Определение прово7 дят по примеру 2 за исключением того, что вместо органического углерода в солевых ВЕ тяжках измеряют содержание общего азота методом сжигания в серной кислоте с Se-катализатором.

Для определения пересчетного коэффициента почву инкубируют по примеру 2, но с дополнительным внесением CaCNOs) в количестве 0,2 мкг N/r и измеряют содержание общего N в солевой вытяжке в начале инкубации и через двое суток, до и после высушивания. Величина К, рассчитанная по формуле: К(е -е -е+е)/(E-e J.), оказалась равной 0,48. Используя найден- коэффициент пересчета, получаем, .что содержание азота в микробной биомассе равно 65 мкг N/r почвы.

Выбор конкретного химического анализа клеточных компонентов, переходящих в раствор после высушивания-ре- гидратации, диктуется конкрет.ными задачами исследования. Так, при изучении круговорота углерода в экосистемах очевддна целесообразность определения микробной биомассы по С, а при изучении превращений азота - по N и т.д. При выборе конкретной модификации способа нужно учитывать также, что процентное содержание углерода в клетках микроорганизмов подвержено значительно меньшему варьированию по

сравнению с содержанием N, Р,. К и других элементов. С другой стороны, определение микробной биомассы по азоту имеет то преимущество, что отношение (е-е)/е достигает наибольшего значения. Это, безусловно, благоприятно сказывается на воспроизводимости результатов.

Определение углеводов, также как белков, аминокислот, нуклеиновых кислот, нуклеотидов, липидов и других соединений представляет интерес с точки зрения усредненной характеристики химического состава микроорганизмов в данной почве, и, возможно, найдет применение при определении биологической активности и индикации почв. По сравнению с прототипом (фу- мигационным методом) предлагаемый способ значительно быстрее (результаты определения становятся известны через сутки, вместо 10-20 сут. по прототипу) при меньшей трудоемкости определения и не требует вредных для здоровья реактивов. Предлагаемый способ также более точен, так как он позволяет более строго-оценить численные значения коэффициента пересче- та к биомассе и исключает неопределенность в отношении контрольного измерения. Луч1иая воспроизводимость способа обусловлена тем, что он предусматривает меньшее число операций (высушивание, получение солевой вытяжки, химический анализ) по сравнению с прототипом (фумигация, удаление паров фумиганта, инкубация- образца почвы, химический анализ) и тем, что при исключении долгосрочной инкубации уменьшается влияние неконтролируемых факторов на результаты определения. Наконец, предлагаемый способ из-за исключения инкубации становится универсально применимым для любьк почв независимо от реакции среды, содержания карбонатов и органических ве- ществ. Формулаизобретения

Способ определения биомассы микроu

организмов в почве, предусматривающий

u

биоцидную обработку образца почвы. Измерение содержания углерода, образуемого из поврежденных клеток микроорганизмов, определение пересчетного коэффициента и количества биомассы расчетным путем, отличающийся те, что, с целью повышения точности определения, биоцидную обработку почвы осуществляют высушиванием при 65-70°С, перед измерением содержания углерода из образца почвы готовят солевую вытяжку, измерение углерода проводят в солевой вытяжке, опред-еление пересчетного коэффициента осуществляют путем инкубации дополнительного свежего образца почвы в присутствии глюкозы в количестве 0,0002- 5 мг/г почвы при полевой влажности, измерения остаточного содержания внесенной глюкозы и расчета по формуле

25

К

(е-е,) ()

30

35

40

45

и и

е и е к

50

где е - содержание углерода в солевой вытяжке из нативного образца почвы;

е - содержание углерода в солевой вытяжке из почвы после высушивания-регидратации, мкг/г почвы;

содержание углерода в солевой вытяжке из проинкубированной почвы соответственно до и после высушивания-регидратации, мкг/г почвы; Е - исходное количество вносимой в почву глюкозы, мкг/г почвы;

Р и Р -количество углерода, образуемого из поврежденных клеток микроорганизмов в проинкубированной и контрольной почве соответственно, мкг/г почвы,

а определение количества биомассы

осуществляют по формуле

X 1 К

MfC г nottSbi

Юf4

Время SbtcyutuBatfua, V