Липосомальная везикула для направленного транспорта биологически активных веществ Советский патент 1987 года по МПК A61K9/50 

fO

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии, и может быть использовано для транспорта лекарств в области мишени,

Цель изобретения - повышение степени селективного поглощения везикул макрофагами.

На чертеже изображена липо гомаль- ная везикула.

Оболочка липосомальной везикулы 1 состоит из фосфолипидов 2 и фибронек- тина, модифицированного дитиодипро- пионил-фосфатидилэтаноламином, причем поверхностный белковый слой оболочки образован белковыми частями 3 молекул модифицированного фибронек- тина, а гидрофобные части молекул, образованные модификатором 4, встроены в оболочку,20

Таким образом, существенными признаками; предлагаемой липосомальной везикулы являются наличие конструктивных элементов - оболочка везикулы содержит специфический внещний поверх- ностный слой, сформированный молекулами модифицированного фибронектина; материалы, т.е. вещества, из которых состоят элементы везикулы - фосфоли13014062

пидный состав оболочки, фибронектин, модифицированный производными фосфолипидов (каждую из молекул которого можно условно разделить на белковую

15

5 часть, образуемую остатком собствен- но фибронектина, и гидрофобную часть, образуемую модификатором)j связь между элементами объекта, характеризующаяся тем, тo одной своей частью (гидрофобной) молекулы модифицированного фибронектина встроены в фосфолипидную оболочку везикулы, а другой (белковой), экспонированной на поверхности оболочки, образуют поверхностный белковый слой.

Схема модификации фибронектина может быть условно выражена следующим образом (в качестве модификатора использован дитиодипропионил-фос- фатидилэтаноламин - ДТДП-ФЭ),

I.ДТДП-ФЭ активируют в водной среде водорастворимым карбодиимидом (рН 3,5),

II,К активированному ДТДП-ФЭ добавляют фибронектин в боратном буфере (рН 8,5). В результате аминогруппы фибронектина модифицируются остатками ДТДП-ФЭ.

карбодиимид

рН 3,5

Нп

.

0-Cч- Protein

О

рН 8;5 Фиёронвнтин

ча

Цель изобретения достигается совокупностью указанных вьппе признаков, относящихся как к составу, так и строению объекта. При этом структура и строение липосомальной оболочки являются не менее существенным признаком, чем состав исходных компонентов, поскольку именно наличие поверхностного белкового слоя обуславливает эффективность поглощения везикул макрофагами,

Липосомальные везикулы получают следующим образом.

часть, образуемую остатком собствен- но фибронектина, и гидрофобную часть, образуемую модификатором)j связь между элементами объекта, характеризующаяся тем, тo одной своей частью (гидрофобной) молекулы модифицированного фибронектина встроены в фосфолипидную оболочку везикулы, а другой (белковой), экспонированной на поверхности оболочки, образуют поверхностный белковый слой.

Схема модификации фибронектина может быть условно выражена следующим образом (в качестве модификатора использован дитиодипропионил-фос- фатидилэтаноламин - ДТДП-ФЭ),

I.ДТДП-ФЭ активируют в водной среде водорастворимым карбодиимидом (рН 3,5),

II,К активированному ДТДП-ФЭ добавляют фибронектин в боратном буфере (рН 8,5). В результате аминогруппы фибронектина модифицируются остатками ДТДП-ФЭ.

, ,

. (П

;5

Белкадая часть молекулы

-Protein-Т Н

Гидро(ри6ная часть молекулы

с

6 р

МодисрыццроВанныи (риВронектин

Модификация фибронектина. Для связывания фибронектина с липосомами использована предварительная гидро5Q фобная модификация молекул белка ди- тиодипропионил-фосфатидилэтаноламином. Для этого 1 мг последнего растворяют в 100 мл-диметилсульфоксида и добавляют 1 мл 0,15 М Nacl, После .

5 энергичного встряхивания к полученному раствору добавляют 2 мг 1-этил- 3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (рН 3,5). Через 10 мин добавляют 2 мг фибронектина, растворенного в

3130

0,7 мл 0,1 М боратного буфера (рН 8,5).

Липосомы готовят из яичного лецитина, общих фосфолипидов и ганглиози- дов печени и холестерина методом обращенных фаз, соотношение фосфолипи- да и холестерина 7:3. Для регистрации захвата в лицосомальную мембрану встраивают необменивающуюся мртку холестерил 14-С-олеат (фирма Amers- ham). Количество фосфолипидов оценивают по содержанию . Белок измеряют по методу Лоури.

Опыт 1, 5 мг лецитина и 1,44 мг холестерина растворяют в хлорофо1)ме и упаривают на роторном испарителе до получения пленки. Полученную пленку растворяют в 3 мл диэтилового эфира и добавляют 1,6 мг модифицирован- кого фибронектина в 1 мл боратного буфера. Полученный раствор обрабатывают ультразвуком. После удаления из раствора на роторном испарителе эфира получают однослойные липосомы, что контролируется электронной микроскопией.

ноос-( CO-TSH-ш -о-р-о

о

..

в тех же концентрациях и при том же времени инкубации.

О п ы т 5. 1 мг фибронектина в 20 мг/мл хелатном буфере (1 мл), содержащем 0,15 М NaCf и 0,1 М Na,,,HPO рН 8,0, смешивают с 10 мл 10%-ного раствора пальмитоилхлорида в ацето- не при 4°С, Через 1 ч осадок пальмитиновой кислоты отцентрифугирывают (12000, 15 мин) и отбрасывают, добавляют равный объем раствора липи- дов (концентрация 10 мг/мл) в том же буфере. Инкубируют 30 мин и диализуют 18 ч против такого же буфера, не содержащего хелата.

При этом самопроизвольно из смешанных мицелл липид - детергент - белок образуются липосомы,в мембрану которых встроен фибронектин.

За структурой образующихся комплексов фибронектин - липосома можно следить методом электронной микроско

ПИИ.

Несвязавшийся белок может быть легко и быстро отделен от липосом флотацией в ступенчатом фиколла или

64

О п ы т 2. Получают фибронектин, модифицированный ДТДП-ФЭ. Смешивают его с равным объемом предварительно сформированных липосом (концентрат

ция липида 3 мг/мл) и инкубируют 20 ч. .

При этом фибронектин встраивается своими гидрофобными остатками в мембрану уже готовых липосом за счет гидрофобного взаимодействия остатков

фосфолипида в молекуле белка с липид- ной мембраной.

О п ы т 3, Проводят аналогично опьп у 2, но фибронектин смешивают с

раствором липида (концентрация 5 мг/мл) в детергенте (2 % хелат, 0,15 М NaCf, 10 мМ , рН 7,-4) и диализуют 18 ч против буфера, не содержащего детергента. При этом образуются липосомы,содержащие молекулы фибронектина на мембране л-ипо- сом, причем остаток фосфолипида белка встраивается в мембрану липосомы. О п ы т 4, Проводят аналогично

опыту 2, но вместо ДТДП-ФЭ используют глутарил-ФЭ.

О

-о-р-о

..

40

45

„

50

гель-фильтрацией в центрифуге на се- фарезе CL 4В.

Используют трансформированные макрофаги мьшш линии 1774. На монослой клеток (7 10 ) в лунке наносят алик- воту липосом и инкубируют при 1 ч. После удаления во флаконы с сцинтилляционной жидкостью ЖС-8 подсчитывают на счетчике RACKBETA 1215 (фирма L КБ).

Для определения эндоцитоза липосом макрофагами клетки преинкубиру- ют 40 мин гликолитическим ингибитором эндоцитоза - йодацетамидом (100 мкмоль).

Пример 1. Сравнивают связывание и эндоцитоз макрофагами (7 10 клеток) липосом из лецитина без фибронектина и покрытых фиброиектином. Содержание липида 1,5 мг/мл и фибронектина 0,7 мг/мл. Данные приведены в табл. 1 и 2.

П р и М е р 2. Сравнивают связывание и эндоцитоз макрофагами липосом из фосфолипидов и ганглиозидов

513

печени. Содержание липида 1,5 мг/мл, ганглиозидов, фибронектина 0,7 мг/мл Данные приведены в табл, 3 и А,

П р и м е р 3, Проверка специфического взаимодействия макрофагов с липосомами, содержащими фибронектин, по сравнению с липосомами, содержащими бычий сывороточный альбумин.

Приготовляют липосомы, содержащие лецитин:холестерин (1:1), в которые встроены через гидрофобную ножку фибронектин и бычий сывороточный альбумин (БСА). Весовое соотношение компонентов то же, что в примере 1, количество альбумина эквивалентно содержанию ФН.

В табл.5 дано количество липосом связавшихся с клетками макрофагов линии 1774 (распадов/мин С-холесте- рино-олеата, связанного с липосомами)

Исследуется кинетика связывания с макрофагами липосом, полученных на основе лецитина и лецитина с фибро- нектином.

В табл,6 приведены данные о свя-, зывшши липосом из лецитина и лецитина с фибронектином с макрофагами 1774 в зависимости от времени инкубации.

Лецитин

0,74±0,18

Примеч ание: После гомогенизации липосон по

размеру ( 4f),

Лецитин 0,37±0,02 Лецитин + фибронектин

2,74±0,42

14066

Таким образом, фибронектин повышает фагоцитоз липосом макрофагами до 20 раз.

Использование изобретения -обеспе- 5 чивает высокую степень захвата липосом макрофагами, стимуляцию фагоцитоза липосом макрофагами, возможност применения липосомальных везикул для транспорта БАБ,

Формула изобретения

Липосомальная везикула для направленного транспорта биологически активных веществ, содержащая оболочку, состоящую из фосфолипидов и внешнего белкового слоя, отличающаяся тем, что, с целью повьппе- ния степени селективного поглощения

везикул макрофагами, оболочка дополнительно содержит фибронектин, модифицированный производными жирных кислот или фосфолипидов, а внешний белковый слой образован белковыми частями молекул модифицированного фибронектина, при этом гидрофобные части его молекул, образованные модифи- каторо, встроены в фосфолипидную оболочку.

Таблица 1

0,4310,02

0,31

Таблица 2

0,29tO,03 0,7310,08

0,08 2,01

13014068

Таблица 3

Захват Захват ли-Эндоцитоз

лНПОсом посом в при-липосом

(nmol сутствии(тшю1

липида) йодацетамидалипида) (nmol липида)

3,67±0,09 1,4410,11 2,23

5,7710,25 2,70±0,45 3-,07

ние. После гомогенизации липосом

по размеру ( 4р).

-Таблица 4

Захват липо- Захват липо-Эндоцитоз

сом (nmol сом в присут-липосом

липида) ствии йодаце-(nmol

тамида (шпо1липида) липида)

1,22±0,08 0,8610,11 0,36

5,6110,59 3,47+0,34 2,14

Таблица 5

и- Распад/мин при температзфе,°С

1

37 4

211 ±3297 1 7 .

+ 2967 ±111304 ±40

ктин.

Лецитин + БСА

600 59

126 ±6

Редактор И,Горная

Составитель Н.Кузенкова Техред М.Ходанич

Заказ 1172/4Тираж 596Подписьое

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул.Проектная, 4

Таблица 6

Корректор С.Шекмар

Изобретение относится к медицине, в частности.к экспериментальной фармакологии, и может быть использовано для транспорта лекарств .в области мишени. Целью изобретения является повьшение степени селективного поглощения везикул макрофагами. Оболочка липосомштьной везикулы 1 состоит из фосфолипидов 2 и фибронек- тина, модифицированного производными жирных кислот или фосфолипидов, причем поверхностный белковый слой оболочки образован белковыми частями 3 молекул модифицированного фибро- нектина, а гидрофобные части молекул (образованные модификатором) встроены в оболочку. 1 ил., 6 табл. р (Л с со 4 о О5