СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИОФИЛИЗИРОВАННЫХ ЛИПОСОМ Российский патент 2000 года по МПК A61K9/19 A61K9/127 

Изобретение относится к медицине, в частности к лекарственным препаратам, а именно к лиофилизированным липосомам, используемым для получения препаратов для внутривенного введения.

Одним из основных требований, предъявляемых к препаратам для внутривенного введения, является тонкодисперсность и однородность препаратов. Если это дисперсия липосом, средний размер липосомных везикул не должен превышать 0,5 - 1,0 мкм (лучше 0,4 мкм), иначе возможно повреждение мелких капиллярных сосудов.

Водные липосомальные эмульсии имеют ограниченный срок хранения, так как липидная оболочка липосом в водных эмульсиях при длительном хранении подвергается перекисному окислению липидов. Кроме того, липосомы в эмульсии при длительном хранении могут агрегировать и оседать в виде осадка. Всего этого можно избежать при лиофилизации (вакуумной низкотемпературной сушке) липосом. Лиофилизированные липосомы выдерживают длительное хранение при сохранении химической и биологической структуры, их легче транспортировать, а для использования в клинике непосредственно перед использованием их редиспергируют в водной среде простым взбалтыванием.

Основная проблема при лиофилизации состоит в том, чтобы после лиофилизации липосомы сохраняли тот же средний размер везикул, а также то же содержание терапевтических средств внутри везикул в тех случаях, когда лиофилизируют липосомы с инкапсулированными лекарственными препаратами.

Известен способ получения лиофилизированных липосом (О.П.Плетнева и др. Вестник АМН СССР, 1990, N 8, c.33-34), согласно которому раствор смеси липидов, включающий 95% яичного фосфатидилхолина (ЯФХ) и 5% фосфатидилэтаноламина, а также холестерин, взятый в соотношении к ЯФХ, равном 1:2, и DL-α-токоферол (1,35 • 10^-3 М на 1M ЯФХ), упаривали в роторном испарителе до образования пленки, пленку диспергировали в водном растворе цитарабина, дисперсию многократно замораживали и оттаивали в горячей воде для получения липосом, к дисперсии липосом добавляли криопротектор сахарозу или трегалозу (60 мг на 1 мл липосом), замораживали при температуре -20^oC и лиофилизировали 24 часа в режиме получения сухого тромбина. Сохранность липосом после лиофилизации контролировали по содержанию в них цитарабина.

В указанном способе не контролировали ни размера липосом, ни распределения по размерам. Однако опыт работы с липосомами показывает, что при получении липосом методом замораживания - оттаивания невозможно получить однородные по размерам частицы, пригодные для внутривенного введения.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту к заявляемому способу является способ получения лиофилизированных липосом (заявка PCT N 90/03795, МКИ A 61 K 37/22), включающий растворение веществ, способных образовывать липидную оболочку липосом в органическом растворителе, высушивание полученного раствора с образованием пленки, ресуспензирование липидной пленки в дисперсионной среде в присутствии криопротектора, диспергирование суспензированных липидов в микроэмульсию, замораживание микроэмульсии при температуре - 18^oC и лиофилизацию в течение 24 часов. В качестве веществ, способных образовывать липидную оболочку, взяты дистеарилфосфатидилхолин и холестерин к мольном соотношении 2:1. В качестве криопротектора используют смесь сахара (сахарозы, трегалозы, лактозы или мальтозы) с протеином (альбумином), пептидом (казеином, желатином) и/или олигопептидом. При этом сахар берут в соотношении к фосфолипидам, равном от 0,5:1 до 10:1, лучше 4: 1, а протеин, пептид или олигопептид в соотношении к фосфолипиду от 1:100 до 2: 1, лучше 1: 1. Использование смешанного криопротектора при лиофилизации липосом позволяет сохранить более 90% липосом неизмененными. При регидратации более 90% лиофилизированных указанным способом липосом сохраняют структуру и размер частиц, а также инкапсулированные лечебные вещества. Однако внесение в медицинский препарат биологически активных, но не оказывающих лечебного воздействия веществ не всегда является оправданным.

Техническая задача, решаемая в заявляемом способе, - это получение неизмененных тонкодисперсных липосом в отсутствие дополнительных биологически активных веществ.

Указанная техническая задача решается тем, что в способе получения лиофилизированных липосом, включающем растворение веществ, способных образовывать липидные везикулы, в органическом растворителе, высушивание полученного раствора с получением пленки, ресуспензирование липидной пленки в дисперсионной среде в присутствии криопротектора, диспергирование суспензированных липидов в микроэмульсию, замораживание микроэмульсии и последующую лиофилизацию, замораживание микроэмульсии проводят при температуре (-35)-(-45)^oC и замороженную эмульсию перед лиофилизацией подвергают закаливанию при температуре (-50)-(-60)^oC.

В качестве веществ, способных образовывать липидные везикулы, в заявляемом способе используют лецитин, например соевый лецитин, гидрированный на 50% соевый лецитин или лецитины животного происхождения, лучше соевый лецитин, холестерин и отрицательно заряженный фосфолипидный компонент (ОЗФК), то есть смесь кислых фосфолипидов, выделяемую из соевых фосфатидов как единый компонент, обладающую следующими свойствами:
кислотное число, мг КОН - 55,0 - 56,0
содержание фосфора, % - 1,7 - 1,8
цветность, мг - 12 - 13
содержание диенов, % - 0,7 - 0,8
содержание триенов, % - 0,1 - 0,2
Липидные вещества взяты в массовом соотношении лецитин : холестерин : ОЗФК, равном (10 - 20) : (1 - 5) : (1,5 - 3), лучше (13 - 15) : (1 - 5) : 2.

Смесь липидных веществ может содержать 1-20 мас.% DL-α-токоферола.

В качестве дисперсионной среды, кроме воды, могут использоваться водные растворы терапевтических веществ, например, таких, какие описаны в патенте РФ N 2071765, МКИ⁶ A 61 K 9/127. В этом случае липосомы содержат инкапсулированные лекарственные вещества.

В качестве криопротектора используются сахара, такие как сахароза или трегалоза, лучше сахароза, которую берут в массовом соотношении к липидам, равном 4:1.

Для получения микроэмульсии суспензию липидов в дисперсионной среде гомогенизируют на гомогенизаторе высокого давления в течение 5-10 минут при перепаде давления от 100-200 ати до нормального. Тонкодисперсную липосомальную эмульсию разливают во флаконы емкостью 250-500 мл, замораживают в спиртовой ванне охлаждающего устройства при температуре спирта (-35) - (-45)^oC в течение всего периода замораживания. Замораживание липосом производят в горизонтальном положении флаконов при медленном вращении вокруг оси. Продолжительность замораживания 30 минут. Затем замороженные липосомы помещают в морозильный прилавок с температурой (-50) - (-60)^oC для закалки. Далее флаконы с липосомами подвергают сублимационной сушке (лиофилизации) в течение 36 - 38 часов до конечной температуры +20-25^oC. Ресуспензирование высушенных липосом проводят растворением их в дистиллированной воде. Ресуспензированные липосомы сохраняют однородность и мелкодисперсность исходных липосом.

Пример 1. 68 мл 10%-ного раствора образующих липосомные везикулы компонентов, а именно соевого лецитина, холестерина, ОЗФК и DL-α-токоферола при соотношении компонентов 13:1:2:4 (вес.), в хлороформе высушивали в круглодонной колбе на роторном испарителе до образования пленки, которую дополнительно высушивали 10 часов в вакуум-эксикаторе. К полученной пленке добавляли в качестве дисперсионной среды 300 мл смеси 4 частей 5%-ной сахарозы и 1 части фосфатного буфера (вес. соотношение сахароза : липиды равно 4:1), pH 7,4, содержимое перемешивали при 35-40^oC до полного смывания пленки. Полученную грубую липосомальную суспензию диспергировали на гомогенизаторе высокого давления фирмы Manton Gaylin в течение 5 мин при перепаде давлений от 100 ати до нормального (число циклов гомогенизирования - 10). Определяли средний диаметр везикул, а также pH среды. Тонкодисперсную липосомальную эмульсию разливали во флаконы емкостью 250 - 500 мл. Липосомы замораживали в спиртовой ванне охлаждающего устройства при температуре спирта -45^oC в течение всего периода замораживания. Замораживание липосом проводили в горизонтальном положении флаконов при медленном вращении вокруг оси в течение 30 мин. Замороженные липосомы помещали в морозильный прилавок с температурой -60^oC для закалки. Далее флаконы с липосомами подвергали сублимационной сушке в течение 36-38 часов до конечной температуры 20-25^oC. Лиофилизированные липосомы исследовали по следующим параметрам: дисперсность липосом определяли методом спектротурбодиметрии. Кислотность среды (pH) измеряли с помощью pH-метра. Данные приведены в таблице.

Пример 2. Липосомы получали как в примере 1, но раствор образующих липосомные везикулы компонентов был составлен из соевого лецитина, холестерина, ОЗФК и DL- α- токоферола при соотношении компонентов 13 : 1 : 2 : 0,5 (вес. ). Липосомальную суспензию замораживали при температуре спирта - 35^oC в течение 30 мин. Замороженные липосомы помещали в морозильный прилавок с температурой -50^oC для закалки. Далее флаконы подвергали сублимационной сушке в течение 36 часов до конечной температуры 20^oC. Лиофилизированные липосомы исследовали как в примере 1, данные приведены в таблице.

Пример 3. 70 мл 10%-ного раствора образующих липосомные везикулы компонентов, в именно гидрированного на 50% соевого лецитина, холестерина и ОЗФК при соотношении компонентов 15:5:2, в хлороформе высушивали до образования пленки. К полученной пленке добавляли 300 мл 10%-ного раствора циклофосфана (лекарственный препарат) в дисперсионной среде, как в примере 1, при соотношении липидсодержащих компонентов и циклофосфана 2,3 : 1. Содержимое перемешивали при 35^oC до полного растворения пленки и диспергировали на гомогенизаторе при перепаде давлений 220 ати в течение 3 мин (6 циклов гомогенизирования). Отделение наполненных липосом от не включившегося в липосомы циклофосфана и замену дисперсионной среды на сахароза-фосфатный буфер проводили методом ультрафильтрации через мембраны типа Халипор 3-20000 при давлении азота 0,5 ати. Отмытые липосомы стерилизовали фильтрацией через фильтр "Миллипор" (⊘ 0,22 мкм). Количественное определение содержания циклофосфана в липосомальной суспензии проводили согласно Гос. фармакопейной статье X роданометрическим методом после разрушения липосом тритоном Х-100. Оно составляли 7 мг/мл. Липосомы замораживали и лиофилизировали, как в примере 1, данные приведены в таблице.

Содержание циклофосфана после ресуспензирования лиофилизированных липосом составляло 7 мг/мл.

Как видно из данных таблицы, при лиофилизации заявляемым способом получаются липосомы, дающие при ресуспензировании однородную тонкодисперсную эмульсию с неизмененным средним диаметром везикул. Сухие липосомы имеют мелкопористую структуру, что способствует их быстрому растворению при использовании.

Изобретение относится к области медицины, а именно к лиофилизированным липосомам, используемым для получения препаратов для внутривенного введения. Способ включает растворение веществ, способных образовывать липидные везикулы, в органическом растворителе, высушивание раствора с получением пленки, ресуспензирование липидной пленки в дисперсионной среде в присутствии криопротектора, диспергирование суспензии липидов в микроэмульсию, замораживание микроэмульсии и последующую лиофилизацию. Замораживание микроэмульсии проводят при температуре (-35)-(-45)^oС и замороженную эмульсию перед лиофилизацией подвергают закаливанию при температуре (-50)-(-60)^oС. В качестве веществ, способных образовывать везикулы, используют лецитин, холестерин, смесь кислых фосфолипидов, выделенную из соевых фосфатидов как единый компонент, и, возможно, DL- α-токоферол. В качестве дисперсионной среды можно использовать водный раствор лекарственных веществ. В качестве криопротектора используется сахароза. Способ позволяет получить липосомы с более длительным сроком хранения и легко ресуспендируемые. 4 з.п.ф-лы, 1 табл.

1. Способ получения лиофилизированных липосом, включающий растворение веществ, способных образовывать липидные везикулы, в органическом растворителе, высушивание полученного раствора с образованием пленки, ресуспензирование липидной пленки в дисперсионной среде в присутствии криопротектора, диспергирование суспензированных липидов в микроэмульсию, замораживание микроэмульсии и последующую лиофилизацию, отличающийся тем, что замораживание микроэмульсии проводят при температуре (-35) - (-45)^oC и замороженную микроэмульсию перед лиофилизацией подвергают закаливанию при температуре (-50) - (-60)^oC. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве веществ, способных образовывать липидные везикулы, используют смесь соевого лецитина, холестерина и смеси кислых фосфолипидов, выделенной из соевых фосфатидов как единый компонент и обладающей следующими свойствами:
Кислотное число, мг КОН - 55,0 - 56,0
Содержание фосфора, % - 1,7 - 1,8
Цветность, мг - 12 - 13
Содержание диенов,% - 0,7 - 0,8
Содержание триенов,% - 0,1 - 0,2
3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что смесь веществ, способных образовывать липидные везикулы, дополнительно содержит 1 - 20 мас.% DL-α-токоферола. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве дисперсионной среды используют водный раствор терапевтического препарата. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве криопротектора используют сахарозу, взятую в массовом соотношении к веществам, способным образовывать липидные везикулы, равном 4 : 1.