Способ определения степени тяжести гипоксии мозговой ткани Советский патент 1983 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно биохимическим способам оцен ки тяжести гипоксии ткани. Известен способ определения степе ни тяжести гипоксии мозговой ткани, включающий исследование содержания макроэргических фосфатов 1. Однако степень изменения этих сое динений может быть невелика даже при острых и глубоких нарушениях снабжения кислородом чувствительньах к гипо сии органов и тканей. Наиболее близким к предлагаемому является способ определения тяжести гипоксии мозговой ткани путем создания гипоксического состояния у экспе риментальных животных, умерщвления .мгновенным замораживанием животного с последующим извлечением мозговой ткани и определением в ней аденозинтрифосфорной кислоты и фосфокреатина 2. Однако .известный способ не позволяет дифференцировать легкую, среднюю и тяжелую формы гипоксии, а также вУявить гипоксическое .повреждение ткани на самых ранних стадиях. Цель изобретенля - дифференцирова ние степеней тяжести гипоксии. Поставленная цель достигается тем что в способе определения степени гипоксии мозгойой ткани, путем создания гипоксического состояния у экспе риментального животного, умерщвления мгновенным замораживанием животного с последуквдим извлечением мозговой ткани и определением в ней адёнозинтрифосфорной кислоты и фосфокреатина отличительной осованностью является то, что в мозговой ткани дополнитель но определяют содержание гуанозинтрй фосфорной кислоты и при снижении содержания гуанозинтрифосфорной кислоты на 30-50% относительно нормы и при нормальном содержании аденозин.трифосфорной кислоты и фосфокреатина определяют легкую степень гипоксии, при снижении гуанозинтрифосфорной кислоты на 51-70% и аденозинтрифосфорной кислоты на 20-40% при нормаль ном содержании фосфокреатина определяют среднюю степень гипоксии, а при снижении гуанозинтрифосфорной кислоты на 71-90%, аденбзинтрифосфорной Кислоты на 50-70%, а фосфокреатина на 40-60% определяют тяжелую степень гипоксии мозга. Способ осуществляют сГЛвяующим об,разом. Исследуемую ткань помещают в жидкий азот, замораживают, затем растирают в тонкий порошок в ступке с АИД КИМ азотом. Навески ткани берут в предварительно тарированные бюксы, содержащие слегка замороженный 10%-й раствор трихлоруксусной кислоты на 0,5 м ЭДТА из расчета 10 мл/г ткани. Пробы экстрагируют в течение 20 мин и фильтруют через бумажные фильтры. ТХУ удаляют трехкратным встряхиванием (по 2 мин) с двумя объемами серного эфира, насыщенного водой. Следы эфира удаляют аэрацией, экстракт нейтралируют до 7,0-;7,4 0,1 NNaOH. ФКр определяют по Эннору и Розенбергу. Для этого пробу помещают в мягкие условия гидролиза (9 мин в 0,4 NHC1 при . Затем раствор нейтрализуют добавлением 0,4 NNaOH и быстро охлаждают до комнатной температуры. Затем добавляют 0,5 мл 0,004 М раствора пара-хлормеркурий бенздата (ПХМБ), 1 мл 1%-го раствора -нафтола и 0,5 мл 0,05%-го раствора диацетила. Объел доводят до 5 мл водой. Содержимое перемешивают, ставят на 30 мин в темноту. Затем измеряют оптическую плотность раствора на ФЭКе при длине волны 540 нм. Нуклеотиды разделяют методом колоночной хроматографии на эктеола-целлюлозе в С1-ФОРме. Количество их определяют по поглощению в ультрафиолете наспектрофотометре СФ-16. Нужную фракцию целлюлозы (150 меш) взвешивают в десятикратном объеме воды, дегазируют и в форме суспензии.вносят в колонку размером 7-70 мм. Сорбцию нуклеотндов проводят со скоростью вытекания раствора 0,07-0,08 мл/мин. Колонку промывают 2-мя мл воды, а затем нуклеотиды элюируют ступенчато растворами НС1 возрастаюцей концентрации (от 0,011 N до 0,1 N) со скоростью 0,120,16 мл/мин. Сбор фракций проводят, капельным методом. Объем каждой фракции доводят до 3 мл, а конечную концентрацию НС1 - до 0,1 N. Оптическую плотность измеряют на СФ-16 с толщиной слоя 1 см при длинах волн 260290 нм для АТФ и 260-310 нм для ГТФ. Расчет концентраций нуклеотидов проводят по коэффициентам молярной экстинции: 14300 - для АТФ, 12200 - для ГТФ. Возврат суммарной экстинции с колонки составляет 98-100%. После определения ссщержания ГФФ, АТФ и Фрк в мкМ/г ткани полученные данные сравнивают с нормой. При этом нормальное для данной ткани содержание ГТФ, АТФ и Фрк принимают за 100%. Содержание ГТФ, АТФ и Окр в.исследуемой на гипоксию ткани выражают в % к норме. Рассчитывают разницу между содержанием ГТФ, АТФ/ Фкр и при гипоксии (в %) и при снижении ГТФ на 40-44% относительно и стабильHcicTH АТФ и Фкр диагностируют легкую степень гипоксии;при снижении ГТФ на 45-50%,АТФ на 10-30% И стабильности Фкр диагностируют среднюю ст.епень тяжести гипоксии;при снижении ГТФ на 60% и более,АТФ на 50% и более/Фкр на 50%. и более - тяжелую форму гипоксии. Примеры конкретного исполнения способа .

Пример. Для определения степени тяжести гипоксического поврезадения ткани мозга у кролика, вьщержанного в течении 30 мин в барокамере на высоте 7000 м, в ткани мозга определяют содержание ГТФ, АТФ, ФКр. В нор ме содержание этих компонентов в мозге кроликов, следукадее: ГТФ - 0,24± ±0,03 мкМ/г ткани; АТФ - 1,76 + ±0,06 мкМ/г ткани; ФКр - 2,53± to,14 мкМ/г ткани.

В исследуемой ткани содержание определяемых компонентов TiakoBo: ГТФ 0,16 мкМ/г ткани; АТФ 1,72 мкМ/г ткани; ФКр- 2,80 мкМ/г ткани.

Следовательнб, имеется снижение содержания ГТФ на 33% относительно ормы, АТФ It ФКр стабильны. Эти изменения соответствуют легкой степени гипоксического повреждения. Ранее известнее способы не позволяли выявить начавшиеся изменения энергетического обмена.

Пример2. В исследуемой ткани выявлены значительные нарушения энергетического обмена, свидетельствукхцие о возникновении гипоксии. С целью оценки тяжести г-ипоксического повреждения ткани мозга проведено определение содержания в ней ГТФ, АТФ и ФКр по предлагаемому способу. Получены следующие результаты: АТФ 1,40 мкМ/г ткани, против 3,03± 0,18 мкМ/г ткани в норме; ГТФ 0,14 мкМ/г ткани против 0,3310,002 в ногяле; ФКр - 3,05 мкМ/г ткани против 3,03±0,i8 в норме.

Таким образом, выявлено снижение 2-х компонентов: АТФ на 33%, ГТФ - . на 58%, что соответствует средней степени тяжести гипоксии.

П р и м е р 3. В исследуемой ткани содержание ГТФ, АТФ, ФКр следующее: .ГТФ - 0,09 мкМ/г против 0,33 мкМ/г-10,02 в.норме; АТФ 0,79 мкН/г против 2,08 мкМ/г О,07 в

Гипоксия

норме; Фкр - 1,47 мкМ/х- гГротив 3,03. 0,18 в норме.

То есть, содержание АТФ снижено на 62%, ГТФ - на 73%,фкр - на 52%, что соответствует тяжелой форме гипоксии. Анализ проведен вслепую. Была взята ткань мозга крысы, подвергшейся действию циркулятора гипоксии в течение 18 ч (35% животных после . такой экспозиции гибнут, что является одним из подтверждений крайне тяжелых и необратимых нарушений знерге тичёского обмена).

Исследованиями ткани ;мозга 50-ти зкспериментальных животных, подвергшихся действию гипоксии различного вида и длительности и контрольной группы (46 опытов) установлено наличие глубоких коррелятивных связей между .изменениями комплекса АТФ, ГТФ, Фкр и.тяжестью гипоксического повреждения ткани.

Гипоксическая гипоксия в барокамере на высоте 7000 м в течение 30 мин (принятая модель легкой степени тяжести гипоксии) характеризуется следующими изменениями комплекса АТФ, ГТФ, Фкр в ткани мозга кроликов Фкр стабилен, 2,83 мкМ/г ткани- мозга + 0,21 против 2,53±0,14 в норме 7ll2% против 100% - различие недостоверно); АТФ - не изменяется, 1,71 0,06 против 1,76±0,06 мкМ/г ткани в норме (97% против 100% - различие недостоверно); ГТФ - снижается на 43,4% 0,16 мкМ/г ткани мозга 0,03 против 0,24i-0,03 в норме.

; Пребывание в барокамере на высоте 8000 м в течение 30, а также перевязка общих сонных артерий на 30 мин (модели гипоксии средней тяжести) вызывали снижение ГТФ на 45%, АТф на 10-30%, ФКр - оставался стабильным.

В таблице показано содержание АТФ ГТФ, ФКр в мозге экспериментальных животных (кролики, крысы) в норме и при гипоксической и циркуляторной гипоксии средней тяжести.

Содержание исследуемых компонентов (мкМ/г ткани мозга)

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ ТЯЖЕСТИ ГИПОКСИИ МОЗГОВОЙ ТКАНИ путем создания гипоксическбго состояния у экспериментального животного. умершрления мгновенным замораживани- ем животного с последукхцим извлечением мозговой ткани и определением в ней аденозинтрифосфорной кислоты и фосфокреатина, отличающийс я тем, что, с целью дифференцирования степеней тяжести гипрк;сии, в мозговой ткани дополнительно определяют содержание гуанозинтрифосфорной кислоты и при снижении содержания гуано- зинтрифосфорной кислоты на 30-50% относительно нормы и при нормальном содержании аденозинтрифосфорной кислоты и фосфокреаткна определяют легкую степень гипоксии, при снижении гуанозинтрифосфорной кислоты на 51-70% и адеi нозинтрифосфорной кислоты на 20-40% при нормальном содержании фосфокреа(Л С тина определяют среднюю степень.гипоксии, а при снижении гуанозинтрифософрной кислоты на 71-90%, аденозинтрифосфорной кислоты на 50-70%, а фосфокреатина на 40-60% определяют g тяжелую степень гипоксии мозга; v rsD О J

Циркуляторная (крысы)

0,l4tO,03

2,OatO,07

3,23tO,21

При циркуляторной гипоксии экспоэицией 18 ч(модель тяжелой формы гипоксии мозга)нарушалась стабильность всех трех компонентов:ГТФ - снижалась на 73% и более(до 0,09 мкМ/г ткани 0,04 - 0,33 мкМ/г ткани + 0,02 в цорме}} АТФ - на 62% (до. 0,79 мкМ/г ткани to,06 с 2,08 мкМ/г ткани ,07 в норме); ФКр - на 50% и более (с 3,03tO,18 мкМ/г ткани в норме до 1,,16 МкМ/г ткани).

Определение содержания АТФ, ГТФ, ФКр в ткани мозга экспериментальных животных проведено в 11 опытах на модели легкой формы гипоксии, в 16 опы тах на моделях средней Формы гипокQHH (8 - гипоксическая гипоксия и 8 цйркуляторна я гипоксия)и в 23 опытах с тяжелой формой гипоксии.

Предлагаемый способ позволяет дифференцировать легкую/ среднюю и тяжелую гипоксии ткани, наприм.ер мозга, а также по снижению содержания в ткани ГТФ позволяет диагностировать гипоксию на более ранней стадии чем известные способы, использующие в качестве раннего критерия гипоксии снижение АТФ. I

Способ позволяет оценить состояние энергетического обмена ткани и тяжесть гипоксических нарушений путем исследования всего трех показателей энергетического обмена.