Способ выделения РSеUDомоNаS маLторнILIа Советский патент 1988 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 C12Q1/04 C12R1/38 

Изобретение относится к медицине, частности к клинической микробиоогии.

Цель изобретения - повьшение точ- с ости способа за счет повышения его селективности.

Пример 1. Исследуем1лй материал (фекалии, гной, раневое отделяеое, полостные экссудаты, моча,кровь, 10 смывы с больничного оборудования) суспендируют в 0,0035-i 0,001 М раствое этилендиаминтетрауксусной кислоы (ЭДТА) в 0,15 М трис-солянокислом буфере (рН 8,7-8,9) и инкубируют при 15 оптимальной для PseudoEonas raaltophi- ia температуре (35 С) в течение 2-2,25 ч. Жидкий исследуемый матери- ал из-за обычно невысокой концентрации микроорганизмов асептически цент- 20 рифугнруют при 3000 об/мин 15 мин, осадок обрабатьшают буферным раствором ЭДТА, Кровь исследуют после прорастания гемокультуры 0,1-0,2 мл суспензии каждого образца исследуемого материала, обработанного буферным раствором ЭДТА, вносят в 5 мл жидкой селективной среды. Посевы инкубируют в термостате.

Среду готовят следующим образом. 30

40-50 г пасты гйдролизата рыбного Дагестанского института питательных сред МЗ СССР (можно использовать питательный бульон на любой основе с содержанием aMHHHOi o азота 100 - 35 150 мг%) тщательно размешивают в 1 л холодной дистиллированной воды,кипятят, фильтруют и разливают во флаконы. Стерилизуют 30 мин при 110°С, рН бульона 7,2-7,5, содержание аминного 40 азота 100-150 мг% Затем в стерильный питательный бульон вносят навески цефазолина натрия, солафура,азида натрия, туда же добавляют стандартный ампульный раствор сизомицина 45 сульфата. Приготовленную селективную среду стерилизуют фильтрацией через стерильный миллипоровский фильтр диаметром пор 0,23 мкм и разливают в стерильные бактериологические пробир-JQ ки по, 5 мл,

Готовят три варианта селективной среды, отличающиеся концентрациями селективных агентов в 1 мг на I л пи- тательного бульона, мг: 1 вариант Цефазолин

натрия.99

Солафур59

1,4 195

00 60

1,5 200

101 61

Сизомиципа сульфат Азид натрия

2вариант Цефазолин

натрия Солафур Сизомицина сульфат Азид натрия

3вариант Цефазолин

натрия

Солафур

Сизомицина

сульфат1,6

Азид натрия 205 Каждый вариант селективной среды испытан на пригодность для выращивания Pseudomonas maltophilia, подвергнутой обработке буферным раствором ЭДТА.

При использовании селективной среды первого и второго вариантов наблюдается хороший поверхностный рост Pseudomonas maltophilia в виде нежной пленки кремового цвета, а при использовании среды третьего варианта слабый поверхностный рост и пленка хуже.

И р и М е р 2. Использование способа выделения Pseudomonas maltophilia с высевом на селективную среду варианта 2 (оптимальные концентрации селективных агентов).

Суточные агаровые культуры 23 ре- фереНС-штаммов суспендируют в 0,0035±0,0001 М растворе ЭДТА в 0,15 М- трис-солянокислом буфере рН 8,7-8,9. Инкубируют в термостате при 35 С в течение 2 ч.

Затем 0,1-0,2 мл суспензии каждой культуры вносят в 5 мл селективной среды, содержащей на 1 л питательного бульона 100 мг цефазолина натрия, 60 мг солафура, 1,5 сизомицина сульфата, 200 мг азида натрия.

Посевы инкубируют при 35°С,. Спустя 18-20 ч наблюдают типичный поверхностный пленочный рост в пробирках с референс-штаммами Pseudomonas maltophilia. В других пробирках видимого роста нет. Контрольные высевы на МПА из этих пробирок роста н е дают.

П р и М е р 3. Влияние концентрации ЭДТА в буферном растворе для обработки материала на воспроизводимость результатов изобретения.

Суточные агаровые культуры 23 ре- ференс-штаммов суспендируют в буферных растворах (рН 8,7-8,9) с тремя различными концентрациями ЭДТА : : 0,0034, 0,0035, 0,0036 М. Суспензии инкубируют при 35°С 2-2,25 ч,Затем 0,1-0,2 мл суспензии каждой культуры вносят в три варианта селективной среды и инкубируют при 35°С.Спустя 18-20 ч и регистрируют поверхностный пленочный рост в пробирках с ре- ференс-штаммами Pseudomonas maltophilia. В остальных пробирках видимого роста нет. Контрольные высевы из этих пробирок на MIIA роста не дают.

При концентрациях ЭДТА в буферном растворе для обработки материала 0,0034 и 0,0035 М наблюдается хороший поверхностный рост в виде неж- ной поверхностной пленки, а при концентрации 0,0036 М пленка скудная, разрушающаяся при прикосновении.

II р и М е р 4. Исследуют 100 проб

мочи, взятых стерильными катетерами от I OO различных урологических больных. Каждую пробу асептически цент- рифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин..Осадок обрабатьшают 0,0035± to,0001 М раствором ЭДТА в 0,15 М трис-солянокислом буфере (рН 8,7 - 8,9) в течение 2 ч при 35°С. Затем 0,1-0,2 мл суспензии каждой пробы вносят в 5 мл селективной среды,содержащей на 1 л питательного бульона из пасты гидролизата рыбного концентрированного цефазолина натрия 99 - 101 мг, солафура 59-61 мг, сизомици- на сульфата 1,4-1,6 кг азида натрия 195-205 мг. Посевы инкубируют при 35 С. Затем регистрируют появление признаков роста. Спустя 20 ч в одной из пробирок появилась нежная поверхностная пленка кремового цвета, т.е. был веделен клинический штамм Pseu- domonas maltophilia. При исследовании тех же проб классическим бактериологическим методом, имеюшим 100% точность, среди уринокультур лишь одна бьта идентифицирована как Pseu- domonas maltophilia. Ее источником бьша та же проба мочи, что при исследовании с помощью данного способа.

ВНИИПИ Заказ 1199 Тираж 520 Подписное Произв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Пример 5. Исследуют образг0 5

0

5

5 0

цы физиологического раствора, содержащие в 1 ил 10 10, 10 и 10 микроорганизмов референс-штаммов. Все образцы центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин. Затем аккуратно отсасывают недостаточную жидкость, оставляя на дне не более 0,5 мл; 0,2-0,3 мл осадочной жидкости вносят в 0,003510,0001 М раствор ЭДТА в 0,15 М трис-солянокислом буфере (рН 8,7-8,9) и инкубируют при 35 С в .течение 2-2,25 ч. После этого 0,2 мл каждой суспензии вносят в селективную среду и инкубируют при . Спустя 18-20 ч наблюдают типичный поверхностный пленочный рост во всех опытных пробирках. В пробирке, соответствующей, концентрации 10 микроорганизмов в 1 мл, пленка очень нежная. Однако при подращивании еще в течение 2,5-3 ч ее невозможно отличить от пленок в других пробирках.

Формула изобретения

Способ вьщеления Pseudomonas maltophilia путем посева исследуемого .. материала на селективную питательную среду, содержащую питательную основу и селективный агент, с последующим учетом характера роста культуры, о тл ичающи и с я тем, что, с целью повышения точности способа, исследуемый материал предварительно обрабатывают в 0,0035±0,0001 М растворе зтилендиаминтетрауксусной кислоты в 0,15 М трис-солянокислом буфере рН 8,7-8,9 и посев осуществляют на питательную среду, содержащую, мг/л:

Цефазолин

натрия99-101

Солафур59-61

Сизамицина

сульфат1,4-1,6

Азид

натрия195-205

Питательный

бульонОстальное

При этом питетельный бульон содержит 100-150 мг% аминного азота.

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической микробиологии. Цель изобретения - повышение точности способа. Исследуемый материал суспендируют в растворе эти- лендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и инкубируют. Жидкий исследуемьш материал асептически центрифугируют. Осадок обрабатывают буферным раствором ЭДТА. Кровь исследуют после прорастания гемокультуры суспензии каждого образца исследуемого материала и вносят в жидкую селективную среду. Посевы инкубируют в термостате. Для приготовления среды можно использовать питательный бульон на любой основе с содержанием аминного азота 100-150 мг %. В стерильный бульон вносят навески цефазолина натрия, солафура, азида натрия, раствора си- зомицина сульфата. Приготовленную селективную среду стерилизуют и разливают в стерильные бактериологические пробирки. 2 табл. € - ZfS