ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS MALTOPHILIA - ПРОДУЦЕНТ ХИТИНОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ Российский патент 1995 года по МПК C12N9/42 C12N1/20 

Изобретение относится к области биотехнологии и может найти применение для получения хитинолитического ферментного препарата.

Известны штаммы рода Pseudomonas, продуцирующие хитиназу [1].

Однако известные штаммы-продуценты хитиназы получены путем введения в них гена, определяющего хитинолитическую активность, причем штаммы-источники данного гена - являются условно патогенными штаммами бактерий.

Известен штамм Serratia marcescens - продуцент хитиназы [2]. Однако известный штамм является условно патогенным для человека и теплокровных животных и поэтому его промышленное применение небезопасно для обслуживающего персонала.

Цель изобретения - выделение природного штамма-продуцента хитинолитических ферментов, непатогенного для человека и теплокровных животных, повышение сохранности окружающей среды за счет использования непатогенного штамма.

Новый штамм выделен из дерновоподзолистой почвы под березняком в Московской области, хранится в коллекции ВКМ под номером CR 332Д.

Штамм характеризуется следующими признаками.

Это неспорообразующие, грамотрицательные, прямые и слабо изогнутые короткие палочки, подвижные, с пучком полярных жгутиков.

Морфологию колоний на питательных средах определяли после 4-5 сут роста при 28^оС.

Колонии на мясопептонном агаре (МПА) слизистые, выпуклые к центру, желтовато-серые, более желтые в центре. Пигмент темно-желтый или коричневый, иногда слабый. На органических средах с тирозином штрих голубовато-черный с темно-бурым, диффундирующим в среду пигментом.

На среде Кинга А пигментация отсутствует.

На среде Кинга Б образуется темно-коричневый, почти черный пигмент, диффундирующий в среду, относящийся к группе меламинов. Зеленый флуоресцирующий пигмент отсутствует.

Физиолого-биохимические признаки.

Не способен расти на минеральной среде без факторов роста (без метионина). С некоторыми источниками углерода на среде Хьюг-Лайфсона в аэробных условиях дает сильную щелочную реакцию. Оксидазная реакция (по Ковачу) отрицательная. Разжижает желатин (через сутки при 28^оС). Пептонизирует и часто отвораживает молоко. Не накапливает поли- β-оксибутират. Не образует леван из сахарозы, не гидролизует крахмал. Продуцирует каталазу, образует сероводород на МПА с цистеином. Активно образует лизиндекарбоксилазу и слабее - аргининдегидролазу. Уреазной активностью не обладает.

Не растет при 4^oС и 41^оС, растет при 35-37^оС, не растет на средах с рН 4,5, растет на МПА с 3% NaCl.

Характерной особенностью является относительно ограниченный спектр углеводных источников, годных для роста. Утилизирует цитрат и малонат Na. Хорошо растет на минеральной среде с аммонийными солями. Нитратные соли не использует в качестве единственного источника азота.

Штамм устойчив к ампициллину (200 мкг/мл), тетрациклину (10 мкг/мл), чувствителен к хлорамфениколу (20-50 мкг/мл), стрептомицину (100 мкг/мл). Штамм не вирулентен для лабораторных животных.

Хранится штамм на косяках карбофельного агара в холодильнике с пересевом на свежие косяки через 2-4 месяца в лиофильно высушенном состоянии (в ампулах) не менее одного года. Для лиофилизации клетки штамма выращивали на агазированном бульоне Хоттингера в течение суток и смывали раствором следующего состава: 1 часть физиологического раствора и 1 часть смеси, состоящей из 10 частей сыворотки крупного рогатого скота без консерванта и 1 части раствора сахарозы в концентрации 1 г/мл.

Штамм идентифицирован: 1 по первоисточнику: Hugh R., Int.J. Syst. Bact. , 1981, v. 31, N 2, р. 195.

2. по первоисточнику - Komagata K. et all. Int. J. Syst. Bact., 1974, v. 24, р. 242,
3. по определителю: Krieg N.R. et al. Bergey,s Manual of Systematic Bacteriology. 1984, v.1.

П р и м е р 1. Определяют хитинолитическую активность нового штамма Pseudomonas maltophilia ВКМ CR-332Д. Для этого штамм выращивают на среде с 2% агара следующего состава, г/л воды: Дрожжевой экстракт 0,5 (NH₄)₂SO₄ 1 MgSO₄ ˙7H₂O 0,3 КН₂РО₄ 1,36
Перед стерилизацией среды рН доводят до 7,0 4%-ным раствором NaOH. В качестве единственного источника углерода в среду вводят коллоидный хитин, полученный из экзоскелета краба обработкой концентрированной HCl.

Коллоидный хитин добавляют в среду в виде водной суспензии (1:1) до конечной концентрации 2% (по объему). Субстрат и соли стерилизовали отдельно. Культивируют штамм на чашках Петри при 28^оС.

Эффективность гидролиза хитина определяли по величине отношения диаметра зоны просветления мутной среды вокруг колонии к диаметру колонии.

Результаты представлены в табл.1 и свидетельствуют о наличии хитинолитической активности у штамма Ps. maltophilia ВКМ CR-332Д.

П р и м е р 2. Обследовали около 70 заведомо непатогенных культур микроорганизмов и установили, что около 30 из них обладают хитинолитической активностью. Среди этих культур подавляющее большинство составляли штаммы вида Pseudomonas maltophilia, причем штамм Preudomonas maltophilia BKM CR-332Д оказался наиболее эффективным. При сопоставлении его хитинолитической активности с активностью трех известных условно патогенных штаммов Serratia marsescens, продуцирующих хитиназу, было показано, что активность нового штамма несколько ниже, однако она достаточно высокая. Основным же преимуществом нового штамма является его непатогенность для человека и теплокровных животных.

Результаты сопоставления приведены в табл.2.

П р и м е р 3. Для получения хитинолитических ферментов штамм Ps. maltophilia CR-332 выращивают на жидкой среде с коллоидным хитином без добавления агара, приготовленной по примеру 1. Среду разливают в пробирки по 10 мл в каждую. В каждую пробирку вносят по 0,1 мл посевного материала и культуру инкубируют при 30^оС в течение 7 дней на качалке со встряхиванием. Затем биомассу отделяют, доводят рН надосадочной жидкости до 6,5 и используют ее как грубый неочищенный препарат хитинолитических ферментов.

Для определения хитинолитической активности препарата в чашки Петри диаметром 100 мм вносили 15 мл той же среды с 2% агара, но без хитина. После застывания среды на нее наносят 10 мл этой же агаризованной среды с хитином. После ее застывания на ее поверхность наносят диски диаметром около 6 мм из фильтровальной бумаги. На каждый диск наносят по 30 мл препарата хитинолитических ферментов. Чашки Петри инкубируют при 35^оС в течение 48 ч. Хитинолитическую активность оценивали по величине зоны просветления агара вокруг дисков. На мутном фоне при наличии хитинолитической активности вокруг дисков видны четкие зоны просветления. Полученные данные аналогичны представленным в табл.1 и 2.

Использование: биотехнология и сельскохозяйственная микробиология и касается штамма, который может быть использован как продуцент хитинолитических ферментов. Сущность изобретения: штамм был выделен из дерново-подзолистой почвы под березняком. Выделенный штамм депонирован в коллекции микроорганизмов ВКМ под номером CR - 332Д. Штамм бактерий Pseudomonas maltophilia ТС-259 подавляет рост различных видов фитопатогенных грибов. Эта группа фитопатогенов связана в своем цикле развития с почвой, они проникают в растение через корневую систему, вызывая сосудистые увядания и корневые гнили растений. Использование штамма ТС-259, естественной зоной обитания которого является ризосфера растений, может быть эффективно как защитное средство против этих фитопатогенов. Штамм может быть использован как продуцент хитинолитической активности и для борьбы с болезнями растений, вызываемыми некоторыми фитопатогенами. 2 табл.

ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS MALTOPHILIA - ПРОДУЦЕНТ ХИТИНОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ.

Штамм бактерий Pseudomonas maltophilia ВКМ CR-332Д - продуцент хитинолитических ферментов.