ШТАММ БАКТЕРИЙ KLEBSIELLA PNEUMONIAE - ПРОДУЦЕНТ ДЕЗООКСИРИБОНУКЛЕАЗЫ Российский патент 1996 года по МПК C12N9/22 C12N9/22 C12R1/22 

Изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к биотехнологии, и может быть использовано в технологическом процессе производства фермента дезоксирибонуклеазы, на основе которого могут быть созданы лекарственные препараты.

Известен штамм Serratiae marcescens мутант В-10 М-1 продуцент дезоксирибонуклеазы [1] наиболее часто используемый в лабораторных условиях.

Недостатком штамма является продукция внеклеточного фермента и его мутантное происхождение, что создает определенные технологические трудности, т.к. на этапе выделения фермента рабочим раствором является среда культивирования. Мутанты, как и генетические рекомбинанты, диссоциируют при глубинном культивировании.

Наиболее близким к предлагаемому является штамм Bacillus cereus [2] Активность ферментосодержащего материала составляет 49,0 ед/мл.

Недостатком прототипа является низкая дезоксирибонуклеазная активность и продукция внеклеточного фермента.

Для получения целевого продукта, штаммы культивируют на жидких питательных средах, биомассу осаждают центрифугированием, а из надосадочной жидкости извлекают дезоксирибонуклеазу.

Целью изобретения является получение нового штамма Klebsiella preumoniae, обладающего стабильным свойством интенсивно продуцировать внутриклеточную дезоксирибонуклеазу, для использования его в технологическом процессе производства фермента, как препарата.

Штамм К. pneumoniae выделен из фекалий ребенка, больного диареей, депонирован в коллекции Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича за N 214 и характеризуется следующими признаками и свойствами.

Свойства штамма К.pneumoniae-214.

Морфологические признаки:
Окраска по Граму: грамотрицательные палочки, жгутиков и опор не образуют.

Окраска в тушевом препарате по Бурри: короткие палочки с четко выраженной капсулой, размер которой составляет 1/2 диаметра тела бактериальной клетки.

Электронно-микроскопические данные: палочки с закругленными концами, размер клетки: длина 1,6±0,16 мкм при ш 95 ширина 0,95±0,02 мкм при ш 95 При просмотре более 1000 клеток жгутики не обнаружены.

Культуральные признаки:
на среде Эндо: колонии темно-розового цвета с более темной окраской в центре, выпуклые с легким серо-металлическим блеском, маслянистые, куполообразные; диаметр колоний 1,5 2,0 мм. Признаков диссоциации нет.

на среде К₂: колонии светло-желтого цвета с более выраженной окраской в центре, маслянистые, куполообразные; диаметр колоний 1,0 1,5 мм. Признаков диссоциации нет.

на среде Ворфеля-Фергюсона: белые блестящие колонии, маслянистые, куполообразные, с ровными краями, диаметр 2-3 мм. Признаков диссоциации нет.

на США: колонии молочно-белого цвета, куполообразные, маслянистые с ровными краями, диаметр 2-3 мм. Признаков диссоциации нет.

Физико-биохимические признаки:
Оптимум роста при температуре 37,0±1^оС, оптимум рН среды 7,0 7,2, оптимальные условия аэробные.

Активно расщепляет глюкозу с образованием кислоты и газа, а также лактозу, маннит, сахарозу, мальтозу, адонит, инозит, сорбит, ксилозу, рамнозу, глицерин. Утилизирует малонат и цитрат натрия, цитрат Козера, декарбоксилирует лизин, обладает уреазной активностью. Дает положительную реакцию Фогес-Проскауэра, т.е. ферментирует глюкозу с обpазованием ацетилметилкарбинола (ацетоина). Не расщепляет дульцит, не образует индол, сероводоpод. Орнитиндекарбоксилаза, аргениндегидролаза и фенил-аланиндезаминаза отсутствуют.

Агглютинируется К-сывороткой К-36 (набор К-сывороток ЦНИИВиС им. Мечникова).

Чувствительность к антибактериальным препаратам:
По результатам исследования методом серийных разведений установлена чувствительность к следующим препаратам, мкг/мл: неомицину 10, канамицину 5, гентамицину 2,5, сизомицину 1, клафорану 25, цефазолину 50, доксициклину 25, хлорамфениколу 5, налидиксовой кислоте 10, триметоприму 25, броксиквинолину 2,5. Устойчив к следующим препаратам, мкг/мл: бензилпенициллину 10, ампициллину 1,5, ампиоксу 1,5, рифампицину 10, эритромицину 75, ристомицину 250, тетрациклину 1,5, полимиксину В 5,0.

Вирулентные свойства: ЛД₅₀ для белых мышей 1,0.10⁹ м.т.

Штамм используют следующим образом.

П р и м е р 1.

Культуру штамма К.pneumoniae-214 засевают в пробирку с 5 мл мясопептонного бульона и выращивают при температуре 37,0±1^оС в течение 3 ч. Полученный таким образом инкубат вносят во флаконы объемом 0,5 л со 100 мл мясопептонного бульона. Флаконы помещают на Шуттель-аппарат роторного типа (60 циклов/мин, шаг платформы 45 мм) и инкубируют при температуре 37,0±1^оС в течение 18 ч. По окончании культивирования культуру инактивируют азидом натрия (1:10000). Биомассу осаждают центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 мин при температуре 4-6^оС. Осадок ресуспендируют в 0,01 М фосфатном буферном растворе (рН 7,2-7,4) до концентрации 20-25 млрд микробных тел в 1 мл и дезинтегрируют на ультразвуковом дезинтеграторе в течение 5 мин при 7-m Ф. Ультразвуковой дезинтеграт осветляют при 8000 об/мин в течение 30 мин при температуре 4-6^оС. Супернатант представляет собой лизат бактериальных клеток (ЛБК) и содержит дезоксирибонуклеазу.

Активность ЛБК определяют методом радиальной диффузии в 1% агаре "Difco" с добавлением дезоксирибонуклеиновой кислоты до конечной концентрации 0,2% и малахитовой зелени (0,001). В агаре пробивают лунки диаметром 4 мм и вносят 25 мкл ЛБК, инкубируют во влажной камере при температуре 37±1^оС. Через 6-12 ч проводят учет. Результаты вышеописанных исследований показывают, что зона просветления субстрата составляет 6-7 мм, что свидетельствует о высокой дезоксирибонуклеазной активности штамма К.pneumoniae-214.

П р и м е р 2.

Сравнительное изучение дезоксирибонуклеазной активности лизата бактериальных клеток и культуральной жидкости штамма К проводят как описано в примере 1.

Как видно из данных табл.1 штамм К.pneumoniae-214 продуцирует преимущественно внутриклеточный фермент, поэтому рабочий объем ферментсодержащей жидкости в 50-42 раза меньше по сравнению с прототипом (табл.2).

П р и м е р 3.

Продуктивность штаммом К.pneumo- niae-214 дезоксирибонуклеазы проводят методом культивирования на жидкой питательной среде, приближенной к таковой прототипа B.cereus (по Кагеяма, 1970).

В ферментер емкостью 2 л загружают 0,9 л стерильной питательной среды, нагревают до температуры 37±1^оС и вносят 0,1 л инокулята, представляющего собой смыв суточной агаровой культуры плотностью 5.10⁹м.т./мл. Культивируют в течение 18 ч при температуре 37±1^оС при вращении магнитного маятника 18-20 об/мин. Далее исследования проводят как описано в примере 1. Исследованию подвергают ЛБК.

Как видно из данных табл.3, штамм К.pneumoniae обладает внутриклеточной продукцией дезоксирибонуклеазы и сравнительно высокой ее активностью.

П р и м е р 4.

Изучение способности штамма К. pneumoniae-214 стабильно продуцировать ДНК-азу проводят следующим образом. Штамм хранят на полужидком агаре под слоем вазелинового масла при 4^оС и лиофильно-высушенный. Через каждые 6 мес подвергают исследованию, как описано в примере 1, с использованием различных питательных сред (пример 1 и 3).

Как свидетельствуют данные табл. 4, штамм К.pneumoniae-214 стабильно продуцирует ДНК-азу в течение 3 лет.

Штамм К. pneumoniae-214 является стабильным продуцентом внутриклеточной дезоксирибонуклеазы. Использование штамма при масштабном получении ферментного препарата обеспечит стабильный выход целевого продукта и упростит технологический процесс. Использование штамма не требует специальных питательных сред и оборудования.

Использование: медицинская микробиология, именно биотехнология, и может быть использовано в качестве штамма-продуцента при промышленном получении ДНК-азы. Сущность изобретения: штамм Klebsiella pneumoniae ГИСК N 214 выделен из фекалий ребенка, больного диареей. ДНК-азу получают путем выращивания штамма на жидкой или плотной питательной среде осаждением биомассы, ультразвуковой дезинтеграцией и центрифугированием при 8000 об/мин в течение 30 мин. Супернатант содержит ДНК-азу. ДНК-азную активность штамма определяют путем посева бляшками на плотную питательную среду, содержащую ДНК, последующих инкубаций при 37^oС в течение 18 - 24 ч и учета. Зона просветления в питательной среде вокруг бляшек свидетельствует о ДНК-азной активности. 4 табл.

Штамм бактерий Klebsiella pneumoniae ГИСК-214 - продуцент дезоксирибонуклеазы.