Способ разделения производных белка и микроорганизмов Советский патент 1987 года по МПК G01N30/00 

Изобретение относится к жидкостной хроматографии и может найти применение при разделении и анализе полидисперсных систем, содержащих биополимеры и микроорганизмы.

Цель изобретения - повышение селективности разделения.

Производные белка и микроорганизмы разделяют путем хроматографичес- кого разделения их в присутствии гетерогенного элюента, представляющего собой перемешенные три жидкие фазы; первая фаза, обогащенная полипропилен10

гликоля с молекуляр1гым весом 1025; 8,5% однозамещенного фосфата калия; 0,1% хлористого натрия; рН среды 8,4. Образовавшиеся три фазы, постоянно перемевшвая, подают в колонку со скоростью 0,33 мл/мин с помощью жидкостного насоса. Анализируемую дисперсную систему, содержащую L- аспарагин (концентрация мг/мл), дактиномицин (концентрация 1 мг/мл), бычий сывороточный альбумин (концент- трация 1 мг/мл), Sarcina flava № 5 (концентрация 1,7 -10 кл/мл) и физиологический раствор вносят в поток

гликолем: вторая фаза, обогащенная

полиэтиленгликолем; третья фаза, обо- 5 элюента с помощью шприца, объем вно- гащенная однозамещенным фосфатом ка- симой пробы 12 мкл. Для регистрации

разделенных компонентов применяют . постколоночное окрашивание 2%-ным флуорескамином, который готовят на ацетоне и подают в проточную кювету со скоростью 0,01 мл/мин. Флуоресценцию окрашенных веществ измеряют

ЛИЯ.

Увеличение-количества разделяющих поверхностей соответственно приводит к увеличению селективности разделения. Для сравнения в классической хроматографии распределение веществ происходит между двумя фазами: неподвижный (носитель, сорбент) и подвиж20

на спектрофлуориметре фирмы Perkin Elmer 1000 ( Д возбуждения - 390 нм.

--- гл.г, f - - ,

ный (элюент), Согласно предлагаемому эмиссии - 505 нм )в проточной кювете способу вещества дополнительно расп- Ю мм, d 0,5 мм, имеющей вход ределяются в гетерогенном злюенте, для непрерывной подачи красителя.

На фиг,1 представлена хроматограм- Хроматограмма разделенных произ- ма анализа производных белка: альбу- водных белка и миороорганизмов пред- мина (пики), дактиномицина (пик fc) , 30 ставленна на фиг,1, L-аспарагина (пик с) и микроорганизмов Sarcina flava № 5 (пик о/); на фиг,2 (пик а) - Хроматограмма альбумина время удерживания 2 мин; на

Перед тем, как анализировать дисперсную систему, были получены хрома- тограммы каждого ее компонента. Времена удерживания отдельных веществ

фиг,3 (пик (з) - Хроматограмма дакти- 35 соответствуют временам удерживания

номицина, время удерживания 5 мин; на фиг,4 (пик с) - Хроматограмма L аспарагина, время удержания 7 мин 30 с; на фиг,5 (пик cf) - хроматограмма микроорганизмов Sarcina flava № 5, 40 фракциям и для каждого отдельного время, удерживания 19 мин 30 с (ус- случая проводили реакцию на наличие

ловия проведения разделения оптимальные) ; на фиг,6 и 7 - хроматограммы анализа производных белка и микроорганизмов в неоптимальных условиях; на фиг,8 и 9 - хроматограммы анализа производных белка и микроорганизмов в условиях, при которых разделение не происходит; на фиг,10 - Хроматограмма анализа производных белка.

Пример 1, Берут колонку из нержавеющей стали (6 250 мм, с 2,5 мм) ,заполняют стеклянными шариками (cJ 0,12 - 0,15 мм). В качестве элюента применяют водный раствор, состоящий из 10% полиэтиленгли- коля с молекулярным весом 4000; 12,,4% полипропиленгликоля с молекулярным весом 425; 2,4% полипропилен

гликоля с молекуляр1гым весом 1025; 8,5% однозамещенного фосфата калия; 0,1% хлористого натрия; рН среды 8,4. Образовавшиеся три фазы, постоянно перемевшвая, подают в колонку со скоростью 0,33 мл/мин с помощью жидкостного насоса. Анализируемую дисперсную систему, содержащую L- аспарагин (концентрация мг/мл), дактиномицин (концентрация 1 мг/мл), бычий сывороточный альбумин (концент- трация 1 мг/мл), Sarcina flava № 5 (концентрация 1,7 -10 кл/мл) и физиологический раствор вносят в поток

элюента с помощью шприца, объем вно- симой пробы 12 мкл. Для регистрации

20

на спектрофлуориметре фирмы Perkin Elmer 1000 ( Д возбуждения - 390 нм.

- - ,

эмиссии - 505 нм )в проточной кювете Ю мм, d 0,5 мм, имеющей вход для непрерывной подачи красителя.

Хроматограмма разделенных произ- одных белка и миороорганизмов пред- тавленна на фиг,1,

Перед тем, как анализировать дисперсную систему, были получены хрома- тограммы каждого ее компонента. Времена удерживания отдельных веществ

этих же веществ при разделении дисперсной системы. Хроматограммы представлены на фиг,2 - 5,

Кроме того, элюент собирали по

аминокислот с нингидрином, белка - реакция с биуретом, полипептида - реакция с биуретом, микроорганизма микроскопия. Аминокислоты в реакцию с биуретом не вступают. В трех остальных фракциях микроскопией исключали присутствие микроорганизмов. Фракции, содержащие полипептид и белок, различали только по их временам удерживания, полученным для каждого вещества отдельно,

Пример 2, Условия проведения хроматографического анализа, окрашивание, регистрация и качественное определение разделенных компонентов аналогичны примеру 1. В качестве злю- ента применяют водный раствор, тоящий из 8% полиэтиленгликоля с молекулярным весом 4000; 10% полипро- пиленгликоля с молекулярным весом 425; 2% полипропиленгликоля с молекулярным весом 1025;7% однозамещен- ного фосфата калия (КН2РО); 0,05% хлористого натрия, остальное вода.

Хроматограмма альбумина-, дактино- мицина, L - аспарагина и Sarcina № 5 представлена на фиг, 6.

Пример 3. .Условия проведения хроматографического анализа, окрашивание, регистрация и качественное определение разделенных компонентов аналогичны примеру 1. В качестве элюента применяют водный раствор, состоящий из 15% полиэтиленгликоля с молекулярным весом (мол,в )4000; 15% Полипропиленгликоля с мол,в. 425; 3% полипропиленгликоля с мол,в. 1025; 10% однозамещенного фосфата калия (КН2Р04); О,15% хлористого натрия (NaCl); остальное вода,

Хроматограмма альбумина, дактино- мицина, L -аспарагина Sarcina flava № 5 представлена на фиг.7.

Пример 4. Условия проведения хроматографического анализа, окрашивание, регистрация и качественное определение разделенных компонентов аналогичны примеру 1, В качестве элюента применяют водный раствор, состоящий из 7% полиэтиленгликоля с мол.в, 4000; 9% полипропиленгликоля с мол.в. 425; 1% полипропиленгликоля

с мол.в. 1025; 6% однозамещенного 35 лективности разделения в качестве фосфата калия ( 0,04% хлорис- элюента используют эмульсию, содер- того натрия; вода остальное. Хроматограмма представлена на фиг,8,

Пример 5, Условия проведения хроматографического анализа, окраши- 40 следующем соотношении компонентов, вание, регистрация и качественное оп- мас.%:

жащую полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, однозамещенньш фосфат калия, хлористый натрий и воду, при

ределение разделенных компонентов аналогичны примеру , В качестве злюента применяют водный раствор, состоящий из 16% полизтиленгликоля с мол.в, 4000; 16% полипропиленгликоля с мол.в. 425; 4% полипропиленгликоля с мол.в, 1025; 11,0% однозамещенного фосфата калия; 0,16% хлористого натрия; остальное вода, Хроматограмма представлена на фиг,9,

На фиг,10 представлены Хроматограмма анализа производных белка;

альбумина (пикоО, дактиномицина (пик i) ii аспарагина (пик с) и микроорганизмов; E.coli 1257 (пико1), Е. coli М-17 (пик &); Serratia marces- cens (пик ); Sarcina flava № 5 (пик

РТаким образом, использование предлагаемого способа по сравнению с известным позволяет разделять дисперс- ную систему, состоящую из аминокисло- ты, дипептида, белка и микроорганизмов (примеры 1-3),

Предлагаемый способ может быть применен в различных областях народного хозяйства, где требуется анализ сложных смесей веществ, например в научно-исследовательских лабораториях для изучения биохимических осо- бенностей роста микроорганизмов; в микробиологической промьппленности для контроля технологического процесса; в медико-биологической промышленности для выделения биологически активных веществ из дезинтегрированной биомассы и т.д.

Формула изобрет. ения

Способ разделения производных белка и микроорганизмов путем хроматографического анализа их в присутствии элюента, отличающий- с я тем, что, с целью повышения селективности разделения в качестве элюента используют эмульсию, содер-

следующем соотношении компонентов, мас.%:

жащую полиэтиленгликоль, полипропи. ленгликоль, однозамещенньш фосфат калия, хлористый натрий и воду, при

Полиэтиленгликоль 4000 Полипропилен- гликоль 425 Полипропилен- гликоль 1025 Однозамещенг ный фосфат калия Хлористый натрий Вода

О 8 1г f6 20 24 гЗмин ф{/. 1

%иА|,

о 8 12 f6 20 г4 28ftf/ фиг. 2

б

Изобретение относится к области жидкостной хроматографии и может найти применение при разделении и анализе полидисперсных систем, содержащих биополимеры и микроорганизмы. Целью изобретения является повьшение селективности разделения. Производные белка и микроорганизмы разделяют путем хроматографического анализа в присутствии гетерогенного элюента, представляющего собой перемешенные три жидкие фазы: первая фаза, обогащенная полипропиленгликолем; вторая фаза, обогащенная полиэтиленгликолем; третья фаза, обогащенная одно- замещенным фосфатом калия, при следующем соотношении компонен-- тов, мас.%: полиэтиленгликоль 4000 10; полипропиленгликоль 424 12; полипропил енгликоль 1025 3; однозамещен- ный фосфат калия 9; хлористый натрий 0,1; вода дистиллированная остальное. 10 ил.

(

о 8/2 fff 20 2 23 Ml/ft

ф1/г.

I I I I (I I I

0 8 12 Г6 , 2D 24 28fff фаг. 4 I

г 1 т 1

г 1 т 1 I I I I 1 I

048 12 16 20- 24 -28 мин

Фиг.5

048

12 Г6 20 24 гЗмин

фиг.6

О 4 8 1Z 16 20 24 28MUH фиг. 7

1ГТГ111 Pllill

о 4 8 12 76 20 г4 28 ffm

фиг. 8

О 4 8 12 76 20 24 28ftfi/ Фиг.З

V/ {

О « 8 72 16 20 24

Фиг.Ю

Составитель И, Борисова / Редактор С.Лисина Техред Л, Сердюкова Корректор М. Демчик

Заказ 1624/42 Тираж 777Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д,Ч/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул.Проектная, 4