Способ разделения смесей биоорганических соединений Советский патент 1983 года по МПК G01N31/08 

10 Изобретение относится к биологии и медицине, в частности к способам разделе ния смесей биоорганических соединений и микроорганизмов. . Известен способ р д еления клеток микроорганизмов,, включающий многократное смешивание и отстаивание л.егкой и тяжелой фаз в копонквр состоящей из ряда камер, с последующим распределением клеток и выведением их из колонки ij; Недостатком является длительность анализа, обусловленная, многоступенчатостью способа разделения. . Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому эффекту является способ разделения смесей биоорганическйх соединений, включающий внесение пробы в колонку- с твердым сорбентом, пропитанным жидкой фазой, с последующим элюированием целевого продукта. Согласно этому способу сорбент насыщают фазой (имеющей к нему сродство)s которая становится неподвижной. Разделяемые вещества распределяют между подвижной (элюент) и неподвижной фазами и выводят из колонки. Этим способом разделяют смесь из бычьего сывороточного альбумина и лизоцкма. Время анализа 2О. ч 2. Недостатком способа является длитель ное время анализа, что обусловлено низкой скоростью движения элюента, так как .неподвижная фаза плохо удерживается сорбентом и смывается с него элюентом. Целью изобретения является ускорение способа./ а также возможность разделения смесей микроорганизмов, Г1Ьстанл.енкая иель достигаетея тем, что согласно способу разделения смесей биоорганических соединений, включающему внесение пробы на колонку с твердым сор бентом, пропитанным жидкой фазой, с последующей элюцией целевого продукта в качестве жидкой фазы используют эмульсию полиэтиленгликоля в растворе солей, эту же эь.(ульсию используют для элюции. Способ поясняется примерами. Пример 1, Анализ смеси квук аминокислот выполненный на колонке с сорбентом, в качестве полимера исполь,зуют ПЭГ-6000, в качестве сопи КН РО. Берут колонку из нержавеющей стали ( 6 250 мм, d 4,6 мм), заполняют пористыми стеклянными щариками с 0,О4Ч),08 мм с порами d 186 А. В качестве элюента применяют водный раствор, состоящий из 10% полиэтиленгликоля типа 6000 (пэг-еооо), 1О% 282 двузамещенного фосфата калия (KPUPQ )/ 0-,% хлористого натрия (ЦаСб), рН 7,0, образовавшиеся две фазы постоянно перемешивают подают в колонку со скоростью 0,4 мл/мин с помощью жидкостного насоса. Фаза, обогащенная сопью, обладает сродством к сорбенту и выполняет роль неподвижной фазы. Анализируемую смесь, содержащую ,-аспарагин и L-изолейцин (концентрация каждой аминокислоты 1О мг/мл), вносят с помощью шприца, объем вносимой пробы 10 мкл. Для |эегистрации аминокислот, вышедших из колонки, применяют их посткопоночное окрашивание 2%-ным фпуорескамином, который готовят на ацетоне.и подают в проточную кювету со скоростью 0,01 мл/мин, Флуоресценцию окрашенных веществ измеряют на спектро4луориметре ( Л возбуж- дения равна 390 нм, Л эмиссии равна 505 нм) в проточной кювете Е 10 мм с d О,5 мм, имеющей дополнительный вход для непрерывной подачи красителя. Смесь аминокислот разделяют за 25 мин, Хроматограмма пробы, содержащей L-аспарагин, представлена на фиг. 1. Хроматограммы пробы, содержащей L- изолейцкн, представлены на фиг. 2, Хроматограмма смеси аминокислот представлена на фиг. 3. Результаты хроматографического аналгза представляются биохимическими исследованиями фракций элюата, Элюат собирают с помощью коллектора фракций и проводят реакцию к шшгвдрином. Пример 2. Анализ смеси белка и полипентида, выполненный на колонке с сорбентом, в качестве полимера используют ПЭГ-6ООО, в качестве сопи KH,jP04. Берут колонку и заполняют ее пористыми стеклянными шариками аналогично примеру 1. Берут элюент, перемешивают и подают в колонку со скоростью 0,4 мл/мин с помощью жидкостного насоса. Анализируемую смесь, содержащую альбумин и циклический декапептид (гра- . мицидин С), вносят с помощью щприпа, объем вносимой пробы 2О мкл. Окрашивание и регистрацию окрашенных биополимеров проводят аналогично примеру 1. Смесь биополимеров разделяют за 40 мин. Хроматограмма пробы,,содержащей альбумин, представлена на фиг, 4. роматограмма пробы, содержащей грамицидин С, представлена на фиг. 5. Хроматограмма смеси биополимеров представлена на фкг. 6„ Результаты хроматографического анализа подтверждаются биохимическими исследованиями фракций элюата. Эпюат собирают с помощью коллекторе фракций и проводят реакциюпо .г Пример 3. Анализ бнёяха и мик poopraHH3Mai выполненный на колонке с сорбентом, в качестве полимера используют ПЭГ-6ООО, в качестве соли KHjPO Берут колонку из нержавеющей стали (С 250 мм, d 4,6 мм), заполняют стеклянными шариками с d 0,18 - 0,25 мм. В качестве элюенга используют водный раствор, состоящий из 10% П:Я-600О, 10% КН,Р(, рН 9,6/Образовавшиеся две фазы пос тоянно переме щнвают подают в колонку со скоростью 0,6 мл/мин с помощью жидкостного насоса. Фаза, обогащенная сопью, обладает сродством к сорбенту и выполняет роль неподвижной фазы. Анализируемую смесь, содержащую альбумин {концентрация 1О мг/мл). и E.CoPi 1257 (кшцентрация 2-10 кл/мл), вносят в колонку с помощью щприца, объем вносимо пробы 4 мкл. Для регистрации белка и микроорганизма, вышедших из колонки, применяют постколоночное окрашивание 2%-ным флуорескамином, который готовят на ацетоне и подают в проточную Kio вету со скоростью 0.01 мл/мин. Флуоре сценцию окрашенных веществ измеряют на спектрофлуориметре ( Л возбуждения равна 39О нм, X эмиссии 50 5 нм) в проточной кювете Ю мм, с d 0,5 мм, имеющей дополнительный вход для непрерывной подачи красителя. Смес альбумина и bstierlilta СоЕг разделяют за 10 Мин. Хроматограмма пробы, содержащей альбумин, представлена на фиг. 7. Хроматограмма пробы, содержащей Е. Coti 1257, представлена на фиг. 8. Хроматограмма смеси альбумина и E.Coli 1257 представлена на фиг. 9 Результаты хроматографнческого анализа подтверждаются биозсимическими (как описано в примере 2) и микроскопическими исследованиями фракций элюата. Пример 4. Анализ двух микроорганизмов E.Cofci 1257 и E.CoRi М-1 вьтолненный на колонке с сорбентом, в качестве полимера используют ПЭГ-60ОО в качестве соли КН2Р . Берут колонку из нержавеющей стали (t 25О мм, d 4,6 мм), заполняют пористыми стеклянными шариками с id О,О7-О,1 мм с порами d 84,3 А, В качестве элюента применяют водный раствор, состоящий из 10% ПЭГ-.60ОО, 1О% iKHiPOj, 0,1% NaCB, ,О. Образовавшиеся две фазы постоянно перемешивают, подают в колонку со скоростью 0,4 мл/мин с помощью жидкостного наcoca. Фаза, обогащенная солью, обладает сродством к сорбенту и выполняет роль неподвижной фазы. Анализируемую смесь микроорганизмов E.Cofi 1257 (кетшентрация 9,95-10 кл/мл) и E.CoE-i М-Г7 (концентрация 1,7-10° кл/мл) вносят в колонку с помсядью шприца. Объем вносимой пробы 1О мкл. Окрашивание и регистраш1ю окрашенных микроорганизмов проводят по примеру 1.. Смесь .микрооргакизмов разделяют за Ю мин. Хроматагракя а , содержащей E. 1257, предста1алена на фиг. 11. Хроматограмма пробы, содержащей E.CoEi М-17 представлена на фиг, Ю. Хроматограмма смеси микроорганизмов представлена :ш фиг. 12. Результаты хро №тографического анализа подтверждаются микроскопическими исследованиями фракций элюата. Эпюат собирают с помощью ксллектора фракций. Пример 5, Анализ микроорга- низма BaciEEuB CereU5 вьшолненный на колсшке с сорбентом, в качестве полимера используют ПЭГ-60ОО, в качестве соли КНлРОл Берут колонку из нержавеющей стали ( 1 25О мм, d 4,6 мм), заполняют пористыми стеклянньпуш шариками с d 0,07-О,1 мм с порами d 84,3 А. В качестве элюента используют водный раствор, состояпдий из 8% ПЭГ-60ОО, 8% КН,. О,1% WaCf, . Образовавшиеся две фазы, постоянно перемешивая, подают в колонку со скоростью О,8 мл/мин с помощью ноидкостнрго насоса. Фаза, обогащенная солью, обладает сродством к сорбенту и выполняет ропь неподвижной фазы. Микроорганизм Вос,СеГвЦ состоящий из вегетативной и споровой форм (л/5О% той и другой формы), .вносят в колонку с помощью шприца, объем вносимый пробы -8 мкл.- Окрашивание и регистрацию окрашенных вегетативной и споровой форм проводят по .примеру 1. Хроматограмма микроорганизма Boc-cereUS представленного двумя формами, имеет два пика (фиг. J 4 ) . Микроскопическ 9 исследования показывают, что первый пик, собранный с помощью коллектора фракций, содержит споровую форму, второй - вегетативную. Время анализа составляет 8 мин. Хроматограмма Вас. сегеив,.содержащей только вегетативную форму, представлена на фиг. 13. Пример 6. Анализ микроорганизма Bac-tligV-l И ien sis содержащего вегетативную и споровую формы, выполненный на колонке с сорбентом, в качест ве полимера используют ПЯ -6ООО, в ка честве соли , Берут колонку из нержавеющей стали ( С 500 мм, d 4,6 мм), заполняют пористыми стеклянными шариками с d О,15-О,18 мм и порами d 126 А. В качестве эяюента используют водный раствор, состоящий иэ 1О% ПЭГ-6ООО, 8% KHjpPO, 0,1% ЫаСЕ и 0,1% тритона Х-1ОО, рН 9,2. Образовавшиеся две фазы, постоянно перемешивая, подают в колонку со скоростью 0,8 мл/мин с помощью жидкостного насоса, Фаза, обогащенная солью, обладает сродством к сорбенту и выполняет роль неподвижно фазы. Микроортанизм Bac.-thoriMoienSIS, состоящий их вегетативной (концентрация 5, кл/мл) и споровой (концент рация 9,8 «10 кл/мл) форм вносят в колонку с помощью шприца,, объем вносимой пробы 2 О мл. Окрашивание и регистраци вегетативной и споровой форм Bac iiur-)n 2 1еибв проводят по примеру 1. Хроматограмма споровой и вегетативной фор Boc.tHuTingfeHsis имеет два пика (фиг. 16 JМикроскопические исследования показывают, что первый пик, собранный с помощью коллектора фракций; содержит споровую форму, второй - вегетативную. Время ана лиза 17 мин. Хроматограмма Вас. tiiur-in gien615, содержащей только вегетативную форму, представлена на фиг. 15. Результаты хроматографического анализа представляется микроскопическими исследованиями фракций элюата. Элюат собирают по фракциям с помощью коллектора фракций. Пример 7. Анализ двух микро организмов E.CoEi 1257и Вас tbuiiKO -lемр Ьна колонке с сорбентом, в качестве полимера используют: ПЗГ-6ООО, в качестве соли KHgPO i Берут колонку из нержавекщей стали ( S 250 мм, ,6 мм), заполняют стеклянными шариками с ,18 0,25 мм. В качестве элюента используют водный раствор,- состоящий из 1О% ПЭГ-60ОО, 10% , рН 9,6. Образовавшиеся две фазы, постоянно перемешивая, подают в колонку со скоростью 0,6 мл/мин с помощью жидкостного насоса. Фаза, обогащенная солью, обладает сродством к сорбенту и вьшолняёт роль неподвижной фазы. Анализируемую смесь микроорганизмов E.CoPi 1257 (концентрация 2, кл/мл) и Bac.-ttiurlMglef iS (концентрация 9-10 кл/мл) вносят в колонку с помощью шприца, объем вносимой пробы 4 мкл. Окрашивание и регистрацию микроорганизмов проводят по примеру 1.Смесь Б. Coti 1257иВасЛЬиГ1и ev)6i6 разделяют за 8 мин. Хроматограмма пробы, содержащей Е. Coft 1257 представлена на фиг. 17. Хроматограмма пробы, содержащей Вас.-tbuK-IMgrieMSi представлена на фиг. 18. Хроматограмма смеси Е. Coti 125 7 и Ъос tViUring -iensiS представлена на фиг. 19. Результаты хроМа1Ч)Графического анализа подтверждаются микроскопическими исследованиями фракций элюата. Злюат собирают с помощью коллектора фракций. Пример 8. Анализ двух микроорганизмов Е. CoEi 1257 и ava № 5,выполненный на колонке с сорбентом,в качестве полимера берут ПЭГ6ООО, в качестве соли . Берут колонку из нержавеющей стали (Е 25О мм, d 4,6 мм), заполняют пористыми стеклянными шариками с d 0,15-0,18 мм и порами d 126 А . В качестве элюента используют водный раствор, состоящий из 10% ПЭГ-6000, 10% , О,1% NaCE, рН-9,2. Образовавшиеся две фазы, постоянно перемешивая, подают в колонку со скоростью 0,2 мл/мин с помощью жидкостного насоса. Фаза, обогащенная солью, обладает сродством в сорбенту и выполняет роль неподвижной фазы. Aнaлизиpye гyю смесь, содержащую E.CoBi 1257 (концентрация 2-10° кл/мл) и Sarcina eava№ 5 (концентрация 5,7-10 кл/мл), вносят в KcwioHKy с помощью шприца, объем вносимой пробы 18 мкл. Окрашивание и ре - гистрацию микроорганизмов проводят по примеру 1.Смесь E.CoEi 1257и5огс1па iEaVa № 5 разделяют за 14 мин. Хроматограмма пробы, содержащей E.CoCi 125 7,представлена на фиг. 20. Хроматограмма пробы, содержащей Sovc-i Q iCovQ № 5,представлена на фиг. 21. Хроматограмма смеси Е.СоН 1257и SOPCivio -iEova № 5 представлена на фиг. 22. Результаты хроматографического анализа подтвер ждаются микроскопическими исследованиями фракций элюата, Элюат собирают с помощью коллектора фракций. Пример 9. Анализ двух микроорганизмов Е.Соб 329 и E.CoE-i АВ 2463, выполненный на колонке с сорьентом, в качестве полимера берут ПЭГ-6ООО, в качестве соли KH.. Берут стеклянную колонку (6 150м в 9 мм), запсяняют пористыми стеклян ными шариками с d 0,1-О,16 мм и по рами 3 126 А. -В к(ачестве элюента используют водный раствор, состоящий из 20% П -600О, 1О% , 0,1%ЫаС . Образовавшиеся две фазы, постоянно перемешивая, подают в колонку со |скоростью 1,8 мл/мин с помощью жид1КОСТНОГО насоса. Фаза, обогащенная со|лью, обладает сродством к сорбенту и {Выполняет роль неподвижной фазы. Аналирируемую смесь, содержащую E.Co6i 329 Лконцентрация 1,4Ю кл/мл) и E.CoC-i АВ 3463 (концентрация 1,О -Ю кл/мл)вносят в колонку с помощью шприца, объем вносимой пробы ЗОО мкл. Окрашивание и регистрацию окрашенных микроорганизмов проводят по примеру 1. Смесь микроорганизмов разделяют за 1О мин. Хроматограмма пробы, содержащей E.CoEi 329, представлена на фиг. 23. Хромате- грамма про&.1, содержащей E.CoW АВ 2463, представлена на фиг. 24. Хроматограмма смеси двух микроорганизмов представлена на фиг. 25. Результаты хроматографического анализа подтверждаются микроскопическими исследованиями фракций элюата. Элюат собирают с помощью коллектора фракций. Пример 10. Анализ трех микро;организмов E.CoKi 1257, E.CaEi 329, E.CoEi Р678-54, выполненный на колонке с сорбентом, в качеодве полимеров I используют декстрансульфат Na (Д50О 5О4«а) в П -600О. Берут стеклянную копакку (Е 15Омм, в 6 мм), заполняют пористыми стеклянными шариками с d 9,О4-О,08 мм и порами d 186 А. В качестве элюента используют водный раствор, состоящий из 10% декстрансульфата Via (Д500 ). 1О% ПЭГ-60ОО, 17,5% НаСе, ,9. Образовавшиеся две фазы, по|стоянно перемешивая, подают в колонку :СО скоростью 1,2 мл/мин. Фаза обогааценная декстрансульфатом Ма, обладает сродством к сорбенту и выполняет роль неподвижной фазы. Анализируемую смесь микроорганизмов E.Coli 1257, E.Coti 329, E.CoBi F678-54 (концентрация микроорганизмов 1 1О кл/мл) вносят в колонку с помощью шприца, объем вносимой пробы 1ОО мкл. Окрашивание и ре гистрацию окрашенных микроорганизмов проводят по примеру 1. Смесь микроорга ниэмов разделяют за 30 мин. Хроматограмма пробы, содержащей E.Copi 1257, ,представлена на фиг. 28. Хроме тограмма пробы, содержащей E.Co€i 329, представлена на фиг. 27. Хроматограмма пробы, содержащей E.Coti Р678-54, представлена на фиг. 26. Хроматограмма смеси трех микроорганизмов представлена на фиг. 29. Результаты хроматографического анализа представляются микроскопическими исследованиями фракций элюата. Элюат собирают с помощью коллектора фракций. Пример 11. Анализ трех микроорганизмов E.CoKi М-17, E.CoBi J-62, Е.Собт 329, выполненный на колонке с сорбентом, в качестве полимеров используют П:Я -4000, ПЭГ-2ОООО, в.качестве соли .. Берут колонку из нержавекяцей стали (б ЗОО мм, d 9,2 мм) заполняют пористыми шариками с ,04-О,О8 мм и порами d 88,8 А. Е качестве элюента используют водный раствор, состояЩИЙ из 6% ПЭГ-400О, 5% ПЭГ-20ООО, UO% К112.РО4., 0,1% NaCE, .0. Образевавшиеся две фазы, постоянно перемешивая, подают в колонку со .скоростью 2,4 мл/мин с помощью жидкостного насоса. Фаза, обогащенная солью, обладает сродством к сорбенту и выполняет рель стационарной фазы. Анализируемую смесь микроорганизмов E.Cpt4 М17 (концентрация 5,0-10° кл/мл 1, E. j-62 (концентрация 5,0Ю кл/мл), E.CoBi 329 (концентрация 2, кл/мл) внеся т в колонку с помощью шприца, объем вносимой пробы ЗОО мкл. Окрашивание и регистрацию окрашенных микроорганизмов проводят по примеру 1. Смесь микроорганизмов разделяют за 1О мин. Хроматограмма пробы, седержшцей E.Coti М-17, представлена на фиг. 32. Хрематеграмма пробы, содержащей E.Coti -62, Представлена на фиг. 31. Хроматеграмма пробы, содержащей E.Coti 329, представлена на фиг. ЗО. Хрематограмма смеси трех микроорганизмов представлена на фиг. 33. Результаты хроматографическоге анализа педтверл;Даются микроскопическими исследованиями фракций элюата. Элюат себ1фают с помощью коллектора фракций. Пример 12. Анализ трех микроерганизмев E.CoP-i 1237, E.CoE-i j-62) E.CoRi yA-8v , выполненный на колонке с сорбентом, в качестве полимера берут ПЭГ-60ОО, в качестве соли . Езерут колонку из нержавеюшой стали (е 25С мм, б- 4,6 мм), заполняют перистыми стеклянными шариками с О р,1-0,16 мм и порами d 126 А. В качестье элюента исполъ,зуют водный рас вор, состоящий иэ 1О% ПЭГ-60ОО, 1О% .КН,Р04, О,1% NaC€, . Образовавшиеся две фазы, постоянно перемешивая, подают в колонку со скоростью 0,4 мл/ми с помощью жидкостного насоса. Фаэа об гащенная солью, обладает сродством к сорбенту и выполняет роль неподвижной фазы. Анализируемая смесь микроорганиз мов E.Coti 1257 (концентрация 5,О 9 кл/мл), E.CoCi УА-87 (концентрация 210 кл/мп) вносят в колонку с помсяцью шприца, объем вносимой 30 мкл. Окрашивание и регистрацию окрашенных микро ганизмов проводят по примеру 1. Смесь микроорганизмов разделяют за 14 мин. Хроматограмма пробы, содержащей E.CoBi 1257, представлена, на фиг. 34. Хроматограмма пробы содержащей E.Coli j-62 представлена на фиг. 35. Хрсжштограмма пробы, содер жащей E.Co&i УА-87, представлена на фиг. 36, Хроматограмма смеси Tjiex микроорганизмов представлена на фиг. 37, Результаты хроматографического анализа подтверждаются микрюскопическими -не- следованиями фракций элюата, Элюат собирают с помощью коллектора фракций. Пример 13. Анализ двух микроорганизмов E,CoP-i М-57, E.CoEi 329 выполненный на капиллярной колонке, в качестве полимера используют ПЭГ-6ООО В качестве сопи . Берут стеклянную капиллярную колонку 6 20 м с внутренним диаметром d О,3 мм. На внутреннюю поверхность капилляра наносят силикон СУ-101. В качестве алюента используют водный раствор, состоящий из 1О% ПЭГ-6ООО, 10% , О,1% NaCe, . Образовавшиеся две фазы подают в колонку со скоростью 0,4 МП/мин с помощью жидкостного насоса. Фаза, обогащенная ПЭГ60ОО, обладает сродством к поверхности капилляра, покрытой силиконом ОУ-1О1, И выполняет роль неподвижной фазы. Анализируемую смесь микроорганизмов Е.Со,Ei М-17 (концентрация 1,41О кл/мл) и iE.CoEi 329 (концентрация 1,4 1О кл/мл вносят в колонку с помощью шприца, объем вносимой пробы 15 мкл..Окрашивание и регистрацию окрашенных микроорганизмов проводят по примеру 1. Анализируемую смесь микроорганизмов разделяют за 15 мин. Хроматограмма пробы, содержащей E.CoLi W-17, представлена на фиг, 39. Хроматограмма пробы, содержащей E.CoEi 329, представлена на фиг. 38. Хроматограмма смеси микроортанизмов представлена на фиг. 40. Результаты хроматографического анализа подтверждаются микроскопическими исследованиями фракций эяюата. Элюат собирают с помощью коллектора фракций. Пример 14, Анализ двух микроорганизмов E.CoEi 1257, E.CoEi М-17, выполненный на капиллярной колонке, в качестве полимера берут ПЭГ-6000, в качестве соли . стеклянную капиллярную колонку 6 22 ы с внутренним 6 0,3 мм. На внутреннюю поверхность капилляра наносят силиконовую фазу ОУ-101. В качестве элюента используют водный раствор, состоящий из 10% ПЭГ-6ООО, 15% KHjjPQj., 0,1% НаСе, рН 7. Образовавшиеся две фазы, постоянно перемешивая, подают в колонку со скоростью 0,4 мл/мин, Фаза, обогащенная ПЭГ-6ООО, обладает сродством к обработанной силиконом поверхности капилляра и выполняет роль неподвижной фазы. Анализируемую смесь микроорганизмов E.Co8i 1257 (концент аация 3,4 1©° кл/мл) и E.Cogi М-17 (концентрация 5,О 10 кл/мл) вносят в колонку с помощью шприца, объем вносимой пробы ЗО, мкл. Окрашивание и регистрацию окрашенных микроорганизмов проводят по примеру 1. Смесь микр.оррГанизмов {разделяют за 8 мин. Хрематограмма пробы, содержащей E.Cofi 1257, представлена на фиг. 41. Хроматограмма смеси, содержащей E.Coti М-17, представлена на фиг. 42. Хроматограмма смеси двух микроорганизмов представлена на фиг. 43. Результаты хроматографического анализа подтверждаются микроскопическими исследованиями фракций элюата. Элюат собирают с помощью коллектора фракций. Пример 15. Анализ двух микроорганизмов E.Co6i НВ-101, E.CoEi 329, выполненный на капиллярной колонке, в качестве полимера берут ПЭГ-6000, в качестве соли KH-PQ. Берут стеклянную капиллярную колонку В 2О м с внутренним диаметром О,3 мм. На внутреннюю, поверхность капилляра наносят силикон ОУ-101. В качестве элюента ислользуют водный раствор, состоящий из 10% ПЭГ-6000, 10% , 0,1% МаСе, рН 7. Образовавшиеся две фазы подают в колонку со ско-, ростью 0,4 мл/мин с помощью жидкостого насоса. Фаза,обогащенная Г1ЭГ-600О бладает сродством к поверхности капиляра, покрытой силиконом ОУ-101, 1) выпопняет роль неподвижной фёаы. Анализируемую смесь микроорганизмов E,Co6i НВ-101 (концентрация 1,4«10 кл/мл) и Е.СоИ 329 (концентрация 1,4 -10 кл/м вносят в колонку с (яцью шприца. Обь ем вносимой пробы 1&мп. Окрашивание регистрацию окрашенных микроорганизмов провохшт по примеру 1. Анализируемую смесь микросфганизмов разделяют за 15 мин. Хроматогрдмма пробы;содержахаей НВ-1О1, представлена на фир. 44. Хроматограмма пробы, содержа|шей Е.СоВГ 329, представлена на .45 bCpoMarorpfiMMa смеси двух ми1фоорганиз JMOB представлена на фиг. 46; Результаты хроматографического анализа подтверждаются микроскопическими исследованиями фракций элюата. Эпюат собирают с помощью кснтектора (| акций. . Пример 16. Анализ двух микроОрганизмов E.Cofi ММ-383, E.Cofi Р67 , выполненный на капиллярной колонке, в.качестве полимера берут ПЭГ- бООО, в качестве соли КН,О. Берут стеклянную капиллярную колонку 6 2О м с внутренним диаметром . О,3 мм. На внутреннюю поверхность капилляра наносят сидикон УО-101. В качестве элюента используют вотый раствор, состоящий из 15% ПЭГ-6ООО, 15% , 0,1% NaCe, . Образовавшиеся две фазы подают в колонку со скоростью 0,4 мл/мин с помощью жишсост- ного насоса. Фаза, обсгащеклая П 60ОО, обладает сродством к поверхности капилляра, покрытой силиконом ОУ101, и выполняет роль неподвижной фазы Анализируемую смесь микроорганизмов ММ-383- (концентрация 1,О« кл/мп) и Е.СоК Р678-54 (концентрация 1,0 - Ю кл/мл) вносят в колонку с помощью шприца, вносимой пробы 15 мкл. Окрашизание и регис рацию окрашенных микроорганизмов про,водят по примеру 1. Анализируемую смес микроорганизмов разделяют за 2 О мин. Хроматограмма пробы, содержащей E.CoCi ММ-383, представлена на фиг. 47. Хроматограмма пробы, содержащей E.Co6i F678-54, представлена на фиг. 48 Хро матограмма смеси микроорганизмов представлена на фиг. 49. Результаты хроматографического анализа подтверждаются микроскопическими исследованиями фракций элюата. Эпюат собирают с помощью колле ктора фракций. Пример 17. АнализЧетырех штаммов E.Coei ММг.383, E.Cofi P67854, E.CoBi 329, E.Cofi HB-lOli выпол ненный на капиллярной колонке, в качестве полимера используют ПЭГ-6ООО, в качестве соли . Берут стеклянную капиллярную колонКу 6 20 м с внутренним диаметром 0,3мм. На внутреннюю поверхность капилляра наносят силикон ОУ-1О1. В качестве элюента используют водный раствор, состоящий из 1О% ПЭГ-6ООО, 15% О,1% НаСС, . Образовавшиеся две фазы подают в колонку со скоростью 0,4 мл/мин с помощью жидкостного насоса. Фаза, обогащенная ПЭ -бООО, обладает сродством к поверхности капилляра, покрытой-силиконом ОУ-1О1, и выполняет роль неподвижной фазы. Анализируемую смесь микроорганизмов E.Co&i ММ383. E.Coei Р678-54, E.Coti 329, E.Cot-i НВ-lOl (кс«центрация каждого микроорганизма 1, кл/мл), вносят в колонку с помсвиью шприца, объем вносимой пробы 15 Мл. Окрашивание и регистрацию окрашенных микроорганизмов проводят по примеру 1. Анализируемую смесь микроорганизмов разделяют за 2О мин. Хроыатограмма пробы, содержащей E.Cot ММг-ЗВЗ, представлена на фиг. 5О. Хр1 атограмма пробы, содержа-щей E.CoN Р678-54, представлена на фиг. 51. Хроматограмма пробы, содержащей E.Cci- 329, представлена на фиг.53. Хроматограмма пробы, содержащей E.Cod НВ-1О1, представлена на фиг. 52. Хроматограмма смеси микроорганизмов преД-ч ставлена на 4«г. 54. Результаты хрюла.гографическотч) анализа подтверждаются микроскопичесжими исследованиями фрак ций зщюата. собирают с помощью коллектора фракций. П р и м е р 18. Анализ двух штаммов E.CoEi ЫВ-1О1, E.CoKi j 53, выполненный на колонке с сорбентом, в качестве полимера берут ПЭГ-бООО, в качестве соли (М1 ).. Берут стеклянную колонку ( мм, d С мм), заполняют пористыми стеклянными шариками с d О,О4-О,О8 мм и порами d 186 А. В качестве элюента используют водный раствор, состоящий из 1О% ПЗГ-6ООО, 15% сульфата аммония (М1-Ц.), . Образовавшиеся две фазы, постоянно перемешивая, подеют в когнжну со скоростью 1,2 мл/мин. Фаза, обогащенная (NH)5O4, обладает cpiMlCTBOM к сорбенту и выполняет роль неподвижной фазы. Анализируемую сМесь микроорганизмов E.CoEi НВ-1О1 и Е.Соti j 53 (концентрация микроорганизмов 1,0 Ю кл/мл) вводят в колонку с помощью .шприца, объем вносимой пробы 100 мл. Окрашивание и регистрацию окрашенных микроорганизмов проводят по примеру 1. Смесь микроорганизмов разделяют за 2О .мин. Х|х матограмма пробы, содержащей E.Coti НВ-1О1, представлена на фиг. 55. Хроматограмма пробы, содержащей E.CoCi J 53, представлена на фиг. 56. Хроматограммы смеси двух микроорганизмов представлены на г. 57-6О

Результаты хроматографического анализа подтверждаются микроскопическими исследованиями фракций элюата. Элюат собирают с помощью коллектора фракций.

Таким образом, использование предлагаемого способа по сравнению с известным обеспечивает следующие преимущества5

сокращение времени анализа за счет увеличения скорости потока и-упрощения анализа до одного цикла;

анализ широкого спектра биологических веществ и микроорганизмов - аминокислоты, белки, антибиотики и клетки без изменения экспериментальных условий (состава элюента, сорбента, скорости потока элюента, рН и т. д.);

сохранение нативных свойств биологического материала за с.чет сокращения . времени анализа (с 20-90 до 1 ч).

СПОСОБ РАЗДЕЛЕНИЯ СМЕСЕЙ БИООРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ, вклюмаюший внесение пробы на колонку с твердым сорбентом, пропитанным жидкой фазой, с последукщей элюцией целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью ускорения способа и возможности разделекня смеси микроорганизмов, в качестве дксА фазы используют эмульсию полиэтиленгянкопя в растворе солей, эту же эмульсию используют для элюции. (О / 7J- 20 2S 30 Вреня, fjUit Фиг.1

J S /о 72 If 16 18 20 22 фиг. 11 II1 24 26 28 ЪОВрвмя,мт 5 I j 5 10 П Tff Тб It 20 22 фиг. 5 7 26 28 30 бремя, мин

III1

13 56783 ОремЯ нин Фиг. 7

12 j 56 7 В 9 8ремя,иим 0ut.B

/«6 8 10 12 1 Вр«ня мин

фигю

-i1-1-I.

2 4 68 10 12 /f , фиг.П

I.I I

68

фиг./2

01 Z Ъ ,

I ,.j

12 /4 Bpe.MUH

10

A.

фиг1У

О 12 3ff BpfMff.MuH

Фи).П

i 2 J i S 6 7 8 9 fO

123 S 678 Время мим

1 2 3 ft 5 6 1 Время,

фиг. /

1 IIj фиИ7 фиг.19

6 Время,мин

фиг.19

О 1 23 45 б 7 в 9 10 Врепя,мин фиг 20

о 2 i 6 в Ю 12 1 Iff 78 0 i29pfftfl,ffuif

lie i w 12 1 /iff if 8pef« tH фиг. 26 0uz.27

J i 6 8 10 12 / Л 18 io il ifpfft off

мии

f 2 5 S 6 7 в 9 Время.мин Фиг. 32

III III1

01 2 3 i S 6 7 В ,ним ФигМ

1 I f

0 1 2 J J 6 7 в 9 Время

Фиг.3$

JII1Li

01 2 3 / 678 Время.мим ф{/г36

мин

016 7 в 9 10 11 12 13 1 Время.мин

фиг.SB

О 1 6 7 В 5 10 11 12 7J / ремя,мин

Фиг. 39

Of 678 9 10 11 12 13 1 Врбмя,мин

/ г 3 56 78 Время мин. фи2А1

1 2 7 8 epeM,ffff« фигЛ2

12 3 S 6 7 8 . фиг.43 f 2 3 5 б 7 8 9 10 11 ФигЛ 1 U -l112 J3 t IS PgJJ / 2 87 8 9 10 11 12 13 фиг.а /i 15 16 ТТ время. мин 1 23 S б 7 6 9 10 11 12 13 t ФигЛб fJ 16 17 время.мин

2 б 8 10 12 1 16 h 20 22 Bpeff f фигМ

2 i 6 В 10 12 П IS IB 20 22 8рЩ Фиг 4f9

ff i 6 В 10 h f4 ie f8 Spefi«.ftuM фиг-5О,

i 6 S 10 h Л J6 18 ,м«н

I I1

±.

фиг.51

г ff 6 в 10 12 /« 16 19 фиг.52

02 б в 10 12 /« 16 18 бремя, мин фиг. 53

о 2 i tf i lo 12 /« Г6 lk ремя, мин it 6 в 10 12 lit ff 18 время.мин Фиг. SS

ill

I I I

2 « 68 10 12 16 18 20 Время. Фиг.56

I I I.

II 1 II II II 12 f 6 8 1О П Iff 16 1B 2 Врмй

Фиг. 57

мин