Способ разделения и анализа биоорганических соединений Советский патент 1989 года по МПК G01N30/06 

Изобретение относится к области физико-химических методов анализа, преимущественно хроматографии, и может быть использовано для анализа и разделения смесей биополимеров и клеток микроорганизмов.

Целью изобретения является снижение- предела обнаружения.

В предлагаемом техническом решении термостатируемьй при 4-25 С гомогенный элюент, представляющий собой водньй раствор полимеров и солей, подают насосом в термостатируемую при 4-60°С хроматографическую колонку, причем температура элюента в колонке отличается от температуры элюента в , предколоночной коммуникации. Вследствие изменения температуры гомогенный поток элюента превращается в гетерогенный (эмульсионный) поток. Для образования гетерогенного элюента непосредственно в колонке в зависимости от качественного состава элюента повышают или понижают температуру элюента в колонке по сравнению с первоначальной, температурой элюента. Разделение целевых продуктов на колонке осуществляют за счет различного их распределения между дисперсной фазой и дисперсионной средой гетерогенного элюента, движущихся с различными скоростями.

Для разрушения эмульсии (превращения гетерогенного потока элюата в гоСП

;о ч

Кд

О)

3-1509

могенный) постколоночную коммуникацию термостатируют при той же температуре, что и емкость с элюептом, или при более низкой (высокой);температуре. Способ может быть осуществлен с использованием как насадочной, так и полой капиллярной хроматографических колонок.

Поток эмульсионного водно-полимерно-солевого элгоата, количественный состав которого близок к критическому, можно обратимо перевести в гомогенное состояние в постколоночной жидкостной коммуникации за счет nepeпада температуры в хроматографической колонке и в постколоночной жидкостной коммуникации, что приводит к -снижению предела обнаружения способа.

На фиг.1 приведена хроматограмма разделения известным способом 3 мкл раствора лизоцима на нативную и денатурированную формы; на фиг.2 - то ,же, предлагаемым способом.

Способ осуществляют следующим образом.

Пример 1. Приготавливают водный элюент, содержащий 10% поли- этиленгликоля с молекулярной массой 4000, 6% калия фосфорнокислого одно- замещенного, 6% калия фосфорнокислого двузамещенного, 0,088% натрия хлорида, рН элюента доводят до величины 7,9 таблетированной гидроокисью калия. Емкость с элюентом устанавливают на магнитную мешалку, и при постоянном перемешивании подают эмульсионный элюент плунжерным насосом с по- стоянным расходом 0,13 мп/мин в хро

0

5

0

30 35

5

Результаты разделения регистрируют на диаграммной ленте самописца.

Результаты разделения смеси на нативную и денатурированную формы лизоцима показан на фиг.1. Вследствие прохождения через кювету оптического детектора потока эмульсии, характеризующейся неоднородностью по. оптической плотности, на диаграммной ленте зарегистрированы высокие флуктуацион- ные щумы. Чем выше флуктуационные шумы, тем выше предел обнаружения способа. Добиться понижения предела обнаружения можно за счет разрушения эмульсии в потоке элюата.

Пример 2. -Приготавливают водный элюент, содержащий 9,68% по- лиэтиленгликоля с молекулярной массой 4000; калия фосфорнокислого однозамещенного, 4,88% калия фосфорнокислого двузамещенного, 0,088% натрия хлорида, рН элюента доводят до величины 7,95-8,0 таблетированной гидроокисью калия. Емкость с гомогенным элюентом термостатируют при 20 С и плунжерным насосом подают элюент с постоянным расходом 0,13 мл/мин в хроматографическую полую капиллярную колонку из кварца. Используют колонку дпиной 24 м (внутренний диаметр 0,2 мм) с химически привитой фазой SE-30. Колонку термостатируют при 60°С для образования .эмульсии в потоке элюента. Постколоночную жидкостную коммуникацию хроматографа термостатируют при 4°С для разрушения эмульсии в потоке элюата. Приготавливают раствор смеси натив

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано для анализа смесей полимеров и клеток микроорганизмов. Цель изобретения - снижение предела обнаружения. Приготавливают водный элюент, содержащий полиэтиленгликоль, калий фосфорнокислый однозамещенный, калий фосфорнокислый двузамещенный и натрий хлорид. Доводят рН элюента до 7,95-8,0. Емкость с гомогенным элюентом термостатируют при определенной температуре и подают элюент с постоянным расходом в хроматографическую колонку. При этом в потоке элюента образовывается эмульсия. Послеколоночную коммуникацию термостатируют при другой температуре. При этом в ней происходит разрушение эмульсии. Детектирование компонентов смеси осуществляют с помощью флуориметра. 2 ил., 1 табл.

матографическую полую капиллярную ко-.40 ной и денатурированной форм лизоцима

ленку из кварца. Используют колонку длиной 24 м (внутренний диаметр 0,2 мм) с химически привитой фазой SE-30 . Приготавливают раствор смеси нативной и денатурированной форм ли- зоцима в 0,05 М растворе натрия тет- рабората с концентрацией 2,5мг/мл. Окрашивают раствор лизоцима раствором флуорескамина в ацетоне с концентрацией 20 мг/мп из расчета 10 мк раствора флуорескамина на 1 мл раствора лизоцима. С помощью микрошприца 3 мкл окрашенного раствора лизоцима вводят в петлю крана-дозатора, заполненную гомогенным элюентом. Переключая кран-дозатор, анализируемый образец вносят в колонку без остановки потока элюента. Детектирование осуществляется с помощью флуориметра

5 Q

5

в 0,05 М растворе натрия тетрабората с концентрацией 2,5 мг/мл. Окрашивают раствор лизоцима раствором флуорескамина в ацетоне, с концентрацией 20 мг/мл из расчета 10 мкл раствора флуорескамина на 1 мл раствора лизоцима. С помощью микрошприца 3 мкл окрашенного раствора лизоцима вводят в петлю крана-дозатора, заполненную гомогенным элюентом.

Переключая кран-дозатор, анализируемый образец вносят в колонку без остановки потока элюента. Детектирование и регистрацию осуществляют, как описано в примере 1. Результаты разделения анализируемого образца лизоцима на нативную и денатурированную формы предлагаемым способом показаны на фиг.2. За счет перепада температуры в постколоночной жидкостной коммуникации хроматографа разрушается эйульсия в потоке элюата. Поток элюата становится гомогенным, оптически однородным и при прохождении через ячейку оптического детектора не вызывает больших флуктуацнонньтх помех. Как видно из сравнения хро- матограмм на фиг,1 и 2, предел обнаружения способа снижается в 4 раза п сравнению с пределом обнаружения при проведении разделения без разрушения эмульсии в потоке элюата.

Примеры осуществления способа и . данные кратности понижения предела {обнаружения биоорганических соедине- 1ний предлагаемым способом приведены ш таблице/

Снижение предела обнаружения позволяет использовать способ в практике заводских лабораторш для определения содеррсания микроколичеств био- :органических примесей в продуктах и I полупродуктах биотехнологического производства, дпя обнаружения микроколичеств выбросов в окружающую среду продуктов и отходов биопроизводства, в котором используются микробы - продуценты биологически активных веществ. На базе способа возможно соз- Ь

дание специализированного жидкостного хроматографа для заводских лабораторий.

0 Формула изобретения

Способ разделения и анализа биоорганических соединений, включающий экстрагирование анализируемых веществ 5 через хромаграфическую колонку пото-- ком водно-полимерно-солевого эмульсионного эяюента и детектирования разделенных компонентов смеси, отличающийся тем, что, с це-- 0 лью снижения предела обнаружения, ,водно-полимерно-солевой эмульсионный |элюент перед детектированием превра- щамт в гомогенный раствор за счет Прохождения его через другую темпера- 5 турную зону, а количественный состав водно-полимерно-солевого элюента выбирают близким к критическому.

О п г

Spends, HVH Ф14г. 1

/2 2 Врепл, мин

Фиг. I