Способ определения относительной активности дегидрогеназ в лейкоцитах крови Советский патент 1987 года по МПК G01N33/48 

13

Изобретение относится к биохимии и может найти применение в медицинской Ирактике.

Цель изобретения - повышение точности и ускорение способа за счет сокращения чцсла приемов и последовательной инкубации мазка крови в средах, содержащих субстраты дегидро- геназ, регистрации оптической плотности инкубационного раствора.

Способ осуществляют следующим образом. .

Мазок готовили из лейкоцитов крови, взятой от доноров для определения в ней фибриногена по стандартной методике, принятой в клинических лабораториях (в 10 мл коническую пробирку, содержащую 0,5 мл 1,35%-ного цитрата натрия, вводили, помешивая, 5 мл венозной крови и центрифугирова ли 5-7 мин при 1500 об/мин на центрифуге с радиусом ротора 10 см). 100 микролитров лейкоцитов, находившихся в пробирке после центрифугирования в виде белой полоски на границе эритроциты - плазма, наносили на стекло и, пользуясь капиллярными силами, втягивали их в стандартный 7,5 см капилляр для определения ге- матокрита, заклеивали его с одного конца замазкой и центрифугировали в режиме определения гематокрита. После центрифугирова1йия из лейкоцитов, находившихся в капилляре в виде белой полоски длиной 0,5-1 см, готовили мазок на предметном стекле размером кюветы имеющегося ФЭКа. После подсушивания на воздухе при комнатной температуре мазок фиксировали в течение 30 с в 70%-ном раство- ре ацетона в ЗР мМ фосфатном буфере при рН 7,4, затем 30 с отмывали в таком же растворе без ацетона и без подсушивания помещали в среду, содержащую субстрат одного из исследуемых ферментов - сукцинатдегидрогеназы (СДГ), ci-глицерофосфатдегидрогеназы (d-ГФДГ) или НАДН-дегидрогеназы.

Все среды содержали 30 мМ неорганического фосфата (любой степени замещенности) при рН 7,4. Первая среда (для определения активности мито- хондриальной oi-ГФДГ) включала ЮмМ

ВНИИПИ Заказ 2655/49 Тираж 776Подписное

Произв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

12

глицерофосфата, 0,3 мМ малоната и 1 мМ тетразолия п-нитротетразолий фиолетовьй (п-НТФ, Rean.-il Венгрия), вторая среда (для СДГ) содержала 1 мМ сукцината и 1 мМ пНТФ, третья (для дегидрогеназ, окисляющих НАДН) 0,2 мМ п-НТФ, 1 мМ малоната и 1 мМ НАДН.

Длительность инкубации мазка в кювете ФЭКа с каждой средой 2 мин соответствует достижению окраски, достаточной для фотометрярования на приборе ФЭК. Больший интервал лишь удлиняет процедуру.

Далее определяют соотношение значений активностей разных дегидрогеназ, полученных при фотометрировании образца с соответствующими субстратами, и сопоставляют с соотношением их активностей в норме.

Исследовано распределение Соотношений активности 3-х ферментов у 32 здоровых доноров, характеризующих .. Отношение активности СДГ/сзС - ГФДГ у всех доноров находилось в интервале 85-115% при среднем значении 100, для отношения НАДН/о -ГФДГ - в интервале 85-115% при среднем значении 100, для отношения НАДН/ -ГФДГ .в интервале 180-240 при среднем 210, т.е. в норме отношение активностей для этих ферментов в лейкоцитах человека характеризуется отклонением от среднего значения на 5-10%.

Формула Изобретения

Способ определения относительной активности дегидрогеназ в лейкоцитах крови, включающий инкубацию мазка в среде, содержащей субстрат и соль тетразолия с последующим фотометрическим измерением, отличающийся тем, что, с целью повьшения точности и ускорения способа, мазок последовательно инкубируют в средах, содержащих субстраты дегидрогеназ, каждый раз регистрируют оптическую плотность инкубацион- ного раствора и по соотношению полученных значенрй определяют относительную активность ферментов.

Изобретение относится к биохимии, предназначено для медицинской практики. Цель изобретения - повышение точности и ускорение способа путем сокращения числа приемов, последовательной инкубации мазка крови в средах с субстратами дегидрогеназ и регистрации оптической плотности инкубационного раствора. Для этого лейкоциты после центрифугирования в виде белой полоски на границе эритроциты - плазма наносят па стекло, втягивают в стандартньш капилляр, центрифугируют, определяя гема- токрит. После центрифугирования из лейкоцитов готовят мазок, фиксир уют 30 с в 70%-ном растворе ацетона в ЗР мМ фосфатном буфере при рН 7,4, затем 30 с отмывают в таком же растворе без ацетона и без подсушивания помещают в среду, содержащую субстрат одного из исследуемых ферментов - сукцинатдегидрогеназы (СДГ), ot-глицерофосфатдегидрогеназы ( ГФДГ) или НАДН-дегидрогеназы. Все среды содержат 30 мМ неорганического фосфата рН 7,4. Первая среда (для определения активности d-ГФДГ) содержит 10 мМ глицерофосфата, 0,3 мМ малонатаи 1 мМ тетразолия п-нитро- тетразолий фиолетовый, вторая среда (для СДГ) содержит 1 мМ сукцината и 1 мМ пНТФ; третья (для дегидрогеназ, окисляющих НАДН) - 0,2 мМ п-НТФ, 1 мМ малоната и 1 мМ НАДН. Длительность инкубации мазка 2 мин соответствует достижению окраски, достаточной для ,фотометрирования. Определяют соотношение активности разных дегидрогеназ, полученных при фо- тометрировании образца с соответствующими субстратами, и сопоставляют с соотношением их активностей к норме. ю (Л 00 to о ел