СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СТАДИИ ОСТРОГО ПИЕЛОНЕФРИТА Российский патент 1998 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в клинической практике для своевременного прогнозирования стадии острого пиелонефрита.

Наиболее тяжелой стадией острого пиелонефрита, неблагоприятной по прогнозу, является гнойное воспаление почки, представляющее угрозу не только потери одного из жизненно важных органов, но и жизни больного. На острые гнойные заболевания почек приходится до 16% от общего количества больных острым пиелонефритом, частота нефрэктомий достигает до 50%, а послеоперационная летальность колеблется от 6,1 до 28,7%. Результаты лечения этой категории больных нельзя считать удовлетворительными и сейчас, в первую очередь это связано с недостаточно точной диагностикой стадии острого пиелонефрита - серьезной воспалительный процесс или гнойное воспаление, что определяет тактику уролога в пользу консервативного или оперативного лечения.

Исследованиями по патентной и научно-медицинской литературе выявлен ряд способов определения характера воспаления в почке.

Известен способ диагностики активного деструктивного процесса в тканях мочевыводящих путей [1]. Здесь предложено определять активность эндогенных фосфолипаз A и C в крови или в моче больного и при наличии их диагностировать деструктивный процесс в мочевых путях. Недостатком метода является то, что он не позволяет судить о тяжести деструкции, кроме того, постановка метода требует длительного времени (более 20 ч) и сложных диагностикумов.

Известен способ ранней диагностики пиелонефрита методом радиоизотопной ренографии В.И.Шаповалова и соавт.[2]. Способ включает гидратацию организма, последующее внутривенное введение фильтруемого в клубочках и секретируемого в канальцах почки радиофармпрепарата, раздельную регистрацию - излучения над областями сердца и обеих почек от каждого радиофармпрепарата и определение из зарегистрированных данных характеристики исследуемого процесса. После гидратации форсируют диурез, из зарегистрированных данных определяют время T_c прохода молекул секретируемого и время T_ф прохода молекул фильтруемого радиофармпрепаратов через почку и при соотношении устанавливают наличие пиелонефрита. Данный метод не дает информации о тяжести воспалительного процесса в мочевых путях и прогнозе его течения, кроме того, метод недоступен для медицинских учреждений, не имеющих радиоизотопной лаборатории, вычисление параметров T_с и T_ф осуществляется с помощью сложного и дорогостоящего электронно-вычислительного оборудования.

Известен способ диагностики острого пиелонефрита А.Ф.Возианова и соавт. [3], основанный на определении лейкоцитоза в правой и левой поясничных областях. Для дифференциальной диагностики серозного и гнойного пиелонефрита авторы определяют локализацию точек минимальной и максимальной температур в каждой из поясничных областей с помощью жидкокристаллического термоиндикатора
Д = 10^-18(Л_1п-Л_2п) - (Л_1л-Л_2л),
где
Д - диагностический показатель;
Д_1п - лейкоцитоз в точке минимальной температуры справа;
Л_2п - лейкоцитоз в точке максимальной температуры справа;
Д_1л - лейкоцитоз в точке минимальной температуры слева;
Л_2л - лейкоцитоз в точке максимальной температуры слева
и при значениях диагностического показателя Д=1,5 диагностируют острый серозный пиелонефрит, а при значениях Д≥ 3 - острый гнойный пиелонефрит. Недостатками метода являются необходимость дополнительной травматизации больных для повторных заборов крови из поясничных областей и трудности его воспроизведения, зависящие от индивидуальных анатомических особенностей пациентов.

В качестве прототипа взят способ диагностики острого пиелонефрита [4] путем определения активности щелочной фосфатазы в лейкоцитах крови больного до и после 2-часовой инкубации крови с почечным антигеном, вычисления среднего гистохимического коэффициента уровня фермента. При значении разницы полученного показателя в сравнении с исходным от 0,2 до 3,0 устанавливают диагноз острого пиелонефрита. Метод обладает низкой информативностью, так как авторы рекомендуют его использовать только для лиц пожилого и старческого возраста, не дает возможности судить о тяжести воспалительного процесса, не позволяет определить стадию острого пиелонефрита, является технически трудоемким, так как для его осуществления необходимо приготовление почечного антигена, а для получения диагностической информации надо произвести вычисление коэффициента, что усложняет процесс диагностики и удлиняет время установления диагноза.

Цель изобретения - повышение точности, упрощение способа, а также сокращение длительности диагностики стадии острого пиелонефрита.

Эта цель достигается биохимическим определением в моче активности ферментов класса оксидоредуктаз-лактатдегидрогеназы (ЛДГ), сукцинатдегидрогеназы (СДГ), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (гл-6-ФДГ).

При значениях ЛДГ от 1,70 и выше, СДГ от 1,60 и выше, гл.-6-ФДГ от 22,20 и выше судят о развитии острого гнойного пиелонефрита, а при изменении удельной активности ЛДГ от 1,62 и ниже, СДГ от 1,58 и ниже, гл-6-ФДГ от 21,10 и ниже - о развитии серозной стадии острого пиелонефрита.

Для осуществления метода у больного производится забор мочи из мочевого пузыря (путем естественного мочеиспускания или катетером). Активность ЛДГ определяли спектрофотометрическим методом по прописи Zimmerman (1956), основанным на восстановлении НАЦ в ферментной реакции с DL-лактатом.

Принцип метода: L - лактат под действием фермента в присутствии НАД окисляется в пируват, который определяется по цветной реакции с нитросиним тетрозолем. Реакция основана на превращении бесцветной окисленной формы тетразолевых солей в окрашенную восстановительную форму за счет НАДН. Оптимум pH 9.

Лактат+НАД пируват + НАДН
НАДН + НСТ (нитросиний тетразолий) НАДН + НСТ (нитросиний тетразолий) _→ НАД + формазан
Ход определения. В центрифужную пробирку приливают поочередно 0,02 М раствор НАД 0,2 мл; 1 мл 0,44%-ного раствора лактата; 0,5 мл боратного буфера pH 9; 1 мл нитросинего тетрозолия 0,1%-ный раствор; 0,5 мл дистиллированной воды и перемешивают. Инкубируют 60 мин при температуре 37^oC. Затем для остановки реакции пробы помещают в холодильник на 20 мин (-4^oC). Осадок отделяют центрифугированием в течение 20 мин при 1500 об/мин. Надосадок сливают. К осадку добавляют 5 мл ацетона для извлечения формазана, выдерживают при нормальных условиях 40-60 мин. Центрифугируют 15 мин при 1500 об/мин. Интенсивность окраски определяют по "СФ N 46" при длине волны 570 нм против ацетона.

Расчет активности ЛДГ проводят по формуле
,
где
γ - концентрация формазана, мкг;
659 - молекулярный вес формазана;
5 - коэффициент пересчета на 1 мл;
1000 - коэффициент пересчета на мкмоль.

Активность СДГ определяют спектрофотометрически по принципу метода, предложенного Nordman et al. (1951) в модификации Е.Ф. Путилиной и Н.Д.Ещенко (1968), основанного на использовании тетразолиевого синего и феназинметасульфата для создания системы переноса электронов от субстрата дегидрогеназой к соли тетразолия с образованием формазана.

Ход определения. Готовят субстратно-буферную смесь. Для этого берут 31 мл сукцината натрия, 1,5 мл MgSO₄, 8 мг АТФ и растворяют в 18 мл фосфатного буфера pH 7,4. К 0,2 мл исследуемой жидкости приливают 2,25 мл субстрата буферной смеси и 1 мл 0,1%-ного тетразолия синего. Пробы инкубируют 60 мин при 37^oC в темноте. Реакцию останавливают помещением проб в ледяную баню. Образовавшийся нерастворимый осадок формазана отделяют центрифугированием. К осадку добавляют 5 мл ацетона, выдерживают при комнатных условиях 40-60 мин и еще раз центрифугируют. Интенсивность окраски определяют на "СФ N 46" при длине волны 570 нм против ацетона.

Расчет активности фермента СДГ проводили по формуле
,
где
γ - концентрация формазана, мкг;
659 - молекулярный вес формазана;
5 - коэффициент пересчета на 1 мл;
1000 - коэффициент пересчета на мкмоль.

Активность Гл-6-ФДГ определяют по методу Корнберга А. в модификации Ю.А. Захарьина (1967) спектрофотометрически по степени восстановления НАДФ в ферментативной реакции с глюкозо-6-фосфатом в присутствии ионов магния.

Ход определения. Реакцию проводят в двух пробирках - основной и контрольной. В реакционную среду, составленную в обеих пробирках из 1 мл трис pH 8,5, 0,2 мл НАДФ 0,002М, 0,2 мл IM MgSO₄, 1 мл H₂O, 0,2 мл мочи. Реакцию в опытной пробирке начинают добавлением 0,4 мл 0,02 М раствора глюкозы-6-фосфата. В контрольной пробирке останавливают реакцию добавлением 1 мл 1,2%-ного раствора NaOH. Пробирки со средой инкубируют 20 мин при 37^oC. Затем останавливают реакцию в опытных пробирках добавлением 1 мл 1,2%-ного раствора NaOH. После центрифугирования проводится спектрофотометрирование надосадочной жидкости при длине волны 340 нм на "СФ N 46".

Для расчетов пользуются стандартной кривой, в качестве стандартного раствора употребляли 0,4 М раствора НАДФН₂.

Расчет активности фермента проводили по формуле
,
где
20 - время инкубации;
γ - концентрация НАДФ, мкг;
833 - молекулярный вес НАДФ;
5 - коэффициент пересчета на 1 мл;
1000 - коэффициент пересчета на мкмоль.

Активность ферментов выражали в мкмоль/л мочи/мин. Содержание ферментов в моче в норме: ЛДГ 1,62±0,14; СДГ - 1,58±0,08; Гл-6-ФДГ - 20,20±1,78.

В процессе апробирования способа проведено обследование 40 пациентов с острым пиелонефритом и 20 практически здоровых лиц.

Полученные результаты, обработанные статистически по методу Р.Б. Стрелкова (1966), приводятся в таблице.

Специфичность способа была рассчитана по методу, предложенному Тиец (1978) по формуле

В соответствии с этой формулой специфичность предложенного способа составляла 90%.

Пример 1. Больная П., 23 лет, поступила в урологическое отделение с диагнозом острый правосторонний необструктивный пиелонефрит, болела до поступления в стационар в течение суток, клиническая картина заболевания была типичной.

При экскреторной урографии функция обеих почек своевременна, пассаж мочи по мочеточникам не нарушен. В общем анализе крови при поступлении лейкоцитоз 15 тыс., палочкоядерных 27. В анализе мочи - пиурия. В процессе лечения через 10 ч после поступления в стационар в общем анализе крови отмечалась положительная динамика.

При биохимическом исследовании мочи активность ЛДГ - 1,92; СДГ - 2,67; Гл-6-ФДГ - 29,52, что указывало на наличие гнойной стадии острого пиелонефрита.

Действительно, несмотря на проводимую интенсивную терапию, состояние больной не улучшилось, нарастали клинические признаки интоксикации и через сутки после поступления в стационар больная была оперирована - обнаружены карбункулы и апостемы правой почки, т.е. наличие гнойного процесса было подтверждено в ходе операции. При этом активность щелочной фосфатазы в крови больной до взаимодействия с почечным антигеном равнялась 1,35 СКГ, а после 2-часовой инкубации с почечным антигеном 5,4 СКГ. Разница полученных показателей равнялась 4,05 СКГ, т.е. не попадала в указанной формуле прототипа интервал, что свидетельствует о неточности способа прототипа у лиц молодого возраста.

Пример 2. Больная Е. , 49 лет, поступила в урологическое отделение с диагнозом острый левосторонний необструктивный пиелонефрит, болела до поступления в стационар около суток, клиническая картина заболевания была типичной.

На экскреторных урограммах функция обеих почек сохранена, обструкции мочевых путей нет. В общем анализе крови - лейкоцитоз 18,5 тыс., палочкоядерных 23. В общем анализе мочи - пиурия. Активность ферментов мочи: ЛДГ - 1,51; СДГ - 1,42; Гл-6-ФДГ - 13,29, что свидетельствовало о серозной стадии острого пиелонефрита, не требующей оперативного лечения.

Действительно, после курса традиционной консервативной терапии состояние больной, начиная со вторых суток стационарного лечения, стало улучшаться. В удовлетворительном состоянии больная была выписана на амбулаторное лечение.

Активность щелочной фосфатазы лейкоцитов периферической крови при поступлении больной в стационар до взаимодействия с почечным антигеном 2,35 СКГ, после 2-часовой инкубации 2,4 СКГ, разница полученных результатов 0,05, т.е. также не укладывается в интервал формулы прототипа и подтверждает неточность способа прототипа у лиц среднего возраста.

По сравнению с прототипом заявляемый способ обладает следующими преимуществами:
1. По изменению активности ферментов ЛДГ, СДГ, Гл-6-ФДГ можно судить о стадии острого пиелонефрита (серозная или гнойная), специфичность способа 90%.

2. Заявляемый способ осуществим быстрее, чем прототип, так как для его осуществления необходимо 2,5 - 3,0 ч, а для осуществления прототипа - до 4 ч.

3. Заявляемый способ технически прост, не требует предварительной подготовки, является не инвазивным.

4. Заявляемый способ применим для всех возрастных категорий больных (взрослых) в отличие от прототипа, осуществимого у больных пожилого и старческого возраста.

Способ осуществляется путем определения в моче больного в первые часы поступления в стационар комплекса ферментов, относящихся к классу оксидоредуктаз; лактатдегидрогеназы, сукцинатдегидрогеназы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и при значении активности первого фермента ниже 1,62 мкмоль/л/мин, второго - ниже 1,58 мкмоль/л/мин, третьего - ниже 21,10 мкмоль/л/мин диагностируют серозную стадию острого пиелонефрита, а при значении первого фермента выше 1,7 мкмоль/л/мин, второго выше 1,6 мкмоль/л/мин, третьего выше 22,2 мкмоль/л/мин диагностируют гнойную стадию острого пиелонефрита. Способ технически прост, точен, дает возможность определить стадии острого пиелонефрита. 1 табл.

Способ диагностики стадии острого пиелонефрита, включающий биохимическое исследование биологической жидкости, отличающийся тем, что в моче больного в первые часы поступления в стационар определяют активность лактатдегидрогеназы, сукцинатдегидрогеназы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и при значении активности первого фермента ниже 1,62 мкмоль/л/мин, второго ниже 1,58 мкмоль/л/мин, третьего ниже 21,10 мкмоль/л/мин диагностируют серозную стадию острого пиелонефрита, а при значении первого фермента выше 1,7 мкмоль/л/мин, второго выше 1,6 мкмоль/л/мин, третьего выше 22,2 мкмоль/л/мин диагностируют гнойную стадию острого пиелонефрита.