Способ получения желатиновых микроносителей для культивирования клеток животных Советский патент 1992 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения микроносителей (МН) для культивирования клеток животных с зависимым от прикрепления к твердой подложке ростом.

Использование МН для выращивания клеток животных позволяет значительно оптимизировать процессы как получения биомассы самих клеток, так и продуктов, синтезированных ими, к примеру гормонов, вирусов и других биологически активных веществ. При этом достигается снижение тру- доемкости биотехнологических процессов в результате того, что появляется возможность испбльзовать для культивирования клеток ферментационного оборудования, и тем самым становится возможным осуществлять процесс в одном объеме культивационной среды.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ получения желатиновых МН для культивирования клеток животных, предусматривающих формирование частиц МН путем диспергирования 10-25%-ного раствора желатины, содержащего 1.4-1,75% глютарового альдегида, в неполярном органическом растворителе с последующей отмывкой сформированных частиц МН и их сепарированием.

Однако получаемые в результате известной обработки желатины частицы МН обладают низкими адгезивными свойствами в отношении клеток животных, что значительно усложняет процесс их использования.

зь

XJ

ю

О iOO

XS

так как при этом необходимы подбор режимов посадки клеток, а также требуется специальное оборудование для осуществления начальных этапов культивирования клеток.

Целью изобретения является повышение адгезивных свойств МН, увеличение выхода клеток и упрощение процесса культивирования.

Для этого в раствор желатины (3,5- 4,0%) вносят дополнительно ДЕАЕ-де- кстран (до 0,14-0,20%), десятикратный раствор ЭРЛА (в объемных соотношениях 100:(2,6-3,0), а для полимеризации желатины в нее добавляют глютаровый альдегид (0,08-0,10%). Полученную смесь охлаждают до образования геля, а гель замораживают при (-20)-(-25)°С, После разморозки геля частиц МН формируют из него путем дробления.

В предлагаемом способе на этапе полимеризации желатины органическая фаза заменена на водную с формированием МН с пористой структурой. Предлагаемая в способе совокупность признаков позволяет получить МН с адгезией достаточной для прикрепления клеток животных во взвесях, что обеспечивает равномерное распределение их на поверхности МН и увеличивает выход клеточной массы.

Способ осуществляют следующим образом.

В 50 мл 3,5-4.0%-ного раствора желатины, приготовленного из пищевой желатины I или II сорта, вносят последовательно ДЕАЕ-декстран до конечной концентрации 0,14-0,20%, десятикратный раствор ЭРЛА в объемных соотношениях 100:(2,6-3,0)и глютаровый альдегид до конечной концентрации 0,08-0,10%, причем последний ингредиент добавляют к раствору желатины капельно, тщательно перемешивая. Последнее обстоятельство вызвано тем, что в нагретом до 50°С растворе желатины глютаровый альдегид вызывает неравномерное формирование геля с узелковыми уплотнениями темного цвета. Затем полученную смесь охлаждают до 4-20°С и выдерживают ее до образования геля (полимеризация). В последующем гель замораживают при (-20)-{-25)0С. Формирова- ние частиц МН производят путем дробления геля в ножевом гомогенизаторе при скорости вращения вала с ножами 100- 250 об/мин в течение 5-7 мин. По своей форме частицы МН представляют ячеистую структуру с размером частиц 0,05-2,0 мм и размером ячеек 40-80 мкм.

Частицы МН в последующем отмывают последовательно в дистиллированной воде и физиологическом растворе. Перед использованием МН стерилизуют автоклавирова- нием, отмывают раствором Хенкса до достижения рН 7.2-7.4 с последующим ресуспендированием МН в питательной среде.

П риме р 1. К50мл 3,5%-ногораствора

желатины добавляют последовательно ДЕАЕ-декстран до конечной концентрации 0,14%, десятикратный раствор Э Р Л А в соот- ношении к объему желатины, равном

0 100:2,6, и глютаровый альдегид до конечной концентрации 0,08%. Полученную смесь выдерживают в течение 2 ч при 4°С до образования геля. Затем гель замораживают при -20°С, оттаивают до комнатной температу5 ры и гомогенизируют до образования частиц размером 0,05-2,0 мм. Полученные частицы отмывают также в избытке физиологического раствора и автоклавируют в этом же растворе при 121°С в течение 20

0 мин, Выход целевого продукта составляет. 45 г (масса влажных частиц МН). После ав- токлавирования МН отмывают раствором Хенкса до рН 7,2-7,4 с последующим ресус- пендировэнием его в питательной среде.

5 П р и м е р 2. Процесс получения частиц МН осуществляют аналогично примеру 1, за исключением того, что конечную концентрацию ДЕАЕ-декстрана доводят в смеси до 0,20%, содержание десятикратного раство0 ра ЭРЛА - до 100:3,0, глютарового альдегида - до конечной концентрации, равной 0,10%. При этом смесь выдерживают при 22°С до образования геля, который в последующем замораживают при -25°С. Выход

5 целевого продукта в этом случае составляет 47 г (влажная масса частиц).

Адгезивную способность МН для клеток животных, в частности для клеток 4647 (перевиваемая линия клеток почек зеленой

0 мартышки) и клеток FAF-28 (перевиваемая линия клеток китайского хомячка Blld-li FAF-28 (клон 237S), исследует при культивировании упомянутых клеток в присутствии МН во взвеси. Через 5 ч после начала куль5 тивирования клеток с носителем из культиватора берут пробу, центрифугированием удаляют культураяьную среду, а осадок, содержащий МН с прикрепленными к его поверхности клетками, обрабатывают смесью

0 0,25%-ного раствора трипсина и 0,02 %-ного раствора Версена, взятых в равных объемных соотношениях, после чего подсчитывают количество ресуспендированных клеток в камере Горяева. Прикрепление клеток

5 4647 к поверхности МН к пятому часу инкубирования составляет 85,4-86%, а прикрепление клеток FAF-28 к этому же сроку инкубирования составляет 87,9-95%. Прирост клеточной массы через б сут культивирования для клеток 4647 является 8,6-8,7- кратным, а для клеток FAF-28 - 8,9-9,1-кратным.

По сравнению с известным способом, где процент прикрепившихся клеток к поверхности желатиновых МП (Цитолар) составляет через 5 ч инкубирования (в оптимальном для этого типа МН режиме, при периодическом кратковременном перемешивании МН с клетками в течение первых 5 ч инкубирования) 72%, а количество прикрепленных клеток к МН, получаемому с помощью предлагаемого способа, увеличивается на 14%. В одинаковых условиях культивирования, а именно в условиях постоянного перемешивания МН с клетками в течение всего срока культивирования, включая и период адгезии, количество при- крепленных клеток к МН, получаемому с помощью предлагаемого способа, на 76% выше, чем при использовании Цитолара. Прирост клеточной массы при использовании предлагаемого МН в 7,1 и 1.3 раза по сравнению с Цитоларом выше соответственно при различных режимах культивирования.

Результаты исследований сведены в таблицу.

5Форму л а изо бретени я

Способ получения желатиновых микроносителей для культивирования клеток животных, включающий полимеризацию раствора желатины с образование геля,

0 формирование частиц микроносителя с последующей их отмывкой, отличающий- с я тем, что, с целью повышения адгезивных свойств частиц микроносителя, увеличения выхода клеток и упрощения процесса их

5 культивирования, перед полимеризацией в 3,5-4,0%-ный раствор желатины дополнительно вносят ДЕАЕ-декстран до конечной концентрации 0,14-0.20%. десятикратный раствор Эрла до объемных соотношений

0 100:(2.6-3,0), полимеризацию геля осуществляют добавлением глютарового альдегида до конечной концентрации 0,08-0,10%. гель замораживают при (-20)-(-25)0С и после замораживания из него формируют частицы

5 микроносителя дроблением.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения микроносителей для культивирования клеток животных. Цель изобретения - повышение адгезивных свойств микроносителя, упрощение процесса культивирования клеток и увеличение выхода клеточной массы. Для этого к 3,5-4,0%-ному раствору желатины добавляют 0,14-0.20% ДЕАЕ-декстрана, 10- кратного раствора Эрла до объемного соот- ношения 1 00:(2,6-3,0)хи глютаровый альдегид до конечной концентрации 0,08- 0,1 %. После формирования геля его замораживают при (-20)-(-25)°С, затем размораживают, дробят, отмывают и стерилизуют. Частицы микроносителя представляют ячеистую структуру с размером частиц 0,05-2,0 мм и размером ячеек 40-80 мкм. По сравнению с прототипом на 14% увеличивается адгезивность частиц микроносителя, выход клеточной биомассы увеличивается в 1,3 раза. Кроме того использование полученного микроносителя исключает необходимость подбора условий в начальный период культивирования клеток. 1 табл. сл

Постоянное переме- имвание после внесения клеточной

60

о,б:о,02

10

7,3±0, t

1,2