СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА Российский патент 1997 года по МПК A61K39/00 

Изобретение относится к иммунобиотехнологии и может быть использовано при получении культуральных вакцин против клещевого энцефалита (КЭ).

Известен способ получения культуральной вакцины против КЭ, предусматривающий заражение вирусом суспензионной культуры клеток фибробластов эмбрионов курицы (ФЭК) с последующей его репродукцией, отделением вируссодержащей жидкости (ВСЖ) центрифугированием, инактивированием, осветлением, обработкой протаминсульфатом, концентрированием и очисткой вируса зональным ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы, отбором и разведением фракций, обладающих повышенной экстинцией и содержащей частицы с константой седиментации в области 200 S, и сорбцией на адьюванте (авт. св. СССР N 1318149, 1979). Однако данный способ дает низкий выход целевого продукта из-за больших потерь антигенов на стадии его выделения и требует применения дорогостоящего оборудования.

Известен также способ получения культуральной вакцины против КЭ, предусматривающий заражение вирусом в дозе 0,05 LD₅₀/кл. трипсинизированной суспензионной культуры клеток ФЭК с последующей его репродукцией, инактивированием, осветлением на сепараторе, очисткой антигена фильтрованием через асбесто-целлюлозные, а затем миллипоровые пластины с размером пор 0,45 мкм и сорбцией на адъюванте (Регламент производства вакцины клещевого энцефалита культуральной инактивированной сорбированной сухой или жидкой N 235-81, утв. 29 декабря 1981 г. Начальником ГУПБВП Минздрава СССР Хлябичем Г. Н.).

Однако получаемый этим способом целевой продукт обладает низкой степенью очищенности. Кроме того, он приводит к большим потерям полуфабрикатов из-за возможной нестерильности.

Целью изобретения является повышение выхода и степени очистки вакцины.

Цель достигается тем, что в способе получения вакцины против КЭ путем заражения вирусом культуры клеток с последующей его репродукцией и инактивированием, выделением, очисткой и сорбцией на адъюванте вирусного антигена вносятся следующие изменения.

1. Культуру заражаемых клеток иммобилизуют на коллагеновом микроносителе (цитодексе, цитополе, цитоларе и т. д.) с диаметром частиц 160-250 мкм.

2. Заражающую дозу устанавливают равной 5-30 LD₅₀/кл.

3. Выделение антигена осуществляют седиментационной обработкой при факторе разделения 7000-12000.

Причинно-следственная связь между указанными изменениями способа и достигнутым положительным эффектом заключается в следующем. Особенность антигенного состава получаемого целевого продукта состоит в том, что, помимо цельного вириона, в нем необходимо сохранить также резко отличающиеся от вириона по размеру и массе несобранные в полный вирион вирусные белки. Нами установлено, что сохранить весь спектр требуемых антигенов позволяет седиментационная обработка суперцентрифугированием в заявленном узком диапазоне значений фактора разделения (в запредельных режимах способ неосуществим, что проиллюстрировано в примере 4). Данная операция технологична только в сочетании с псевдосуспензионным культивированием вируса в клетках на вышеуказанных микроносителях (МН), которые обеспечивают не только жизнеспособность клеточного монослоя, но и уменьшают тем самым образованием балластного клеточного детрита и, стало быть, попадание его в целевой продукт. При этом другие испытанные нами известные МН, а также коллагеновые МН с иными размерами частиц для данного способа непригодны или мало пригодны (см. пример 2). Заражающая доза избирательно установлена в связи с обсужденными изменениями способа. Она заявлена в качестве отличительного признака, поскольку резко (на 2 порядка) превышает прототипное значение.

В качестве субстрата для репродукции вируса КЭ целесообразно использовать не трипсинизированную (как в известных способах), а дезагрегированную культуру ФЭК или диплоидную культуру клеток легкого эмбриона человека (ЛЭЧ). В случае использования иммобилизованной трипсинизированной культуры ФЭК большое количество клеток не способно прикрепиться к поверхности МН из-за значительного повреждения их оболочки на стадии ферментолиза. Поврежденные клетки увеличивают содержание балластных белков и затрудняют процесс выделения и очистки антигена. При выращивании же вируса КЭ в клетках иммобилизованной дезагрегированной культуры ФЭК получаемый вирусный субстрат может быть подвергнут дальнейшей обработке (заявленными приемами).

Преимущество использования клеток ЛЭЧ заключается в их родстве вакцинируемому человеку. Кроме того, они не содержат посторонних сопутствующих агентов например, вируса лейкоза птиц.

Возможно проведение дополнительной очистки вирусного антигена осаждением примесных белков протаминсульфатом.

Пример 1. Готовят трипсинизированную и дезагрегированную культуру клеток ФЭК.

Трипсинизированную культуру получают размельчением тушек куриных эмбрионов в гомогенизаторе с последующей обработкой 0,1 мас. трипсина Дифко при 31^oC в течение 4 мин при перемешивании, отмывкой охлажденной средой 199 и выделением клеток с помощью центрифугирования на рефрижераторной центрифуги в течение 10 мин при 500-700 об/мин. Далее готовят взвесь этих клеток в среде 199, содержащей 0,1 об. гидролизатора лактальбумина (ГЛА), 0,1 об. человеческого сывороточного альбумина (ЧСА), 5 мас. аминопептида и 0,1 об. куриного эмбрионального экстракта. Кроме того, часть трипсинизированных ФЭК иммобилизуют на МН цитодексе с размером частиц 180 мкм. Для этого МН обрабатывают 500 мас. ч. солевого раствора Хэнкса рН 7,1 в течение 1 сут при комнатной температуре. За это время происходит набухание МН. Далее МН стерилизуют автоклавированием при 110^oC в течение 10 мин, охлаждают, промывают 500 мас. ч. раствора Хэнкса и тем же количеством среды 199, после чего заливают 500 мас. ч. среды 199 с 10 об. сыворотки крупного рогатого скота и 100 ед/мл пенициллина и каномицина, выдерживают в течение 1 сут при комнатной температуре и хранят в бытовом холодильнике. На обработанный МН наносят клеточную взвесь ФЭК из расчета 1 млн. клеток на 1 мл общего объема реакционной смеси. Клеточный монослой формируется на МН через 3 сут, после чего надосадочную ростовую среду сливают, промывают МН с иммобилизованными клетками трехкратного солевым раствором Хэнкса (для удаления гетерогенного белка) и заливают 9 объемами поддерживающей среды 199 с 0,1% ГЛА. В смесь вносят по 1 мас. 100-кратных концентратов аминокислот и витаминов среды Игла и по 5 об. аминопептида и ЧСА.

Дезагрегированную культуру получают механическим размельчением тушек куриных эмбрионов с последующей обработкой диспергентом (изотоническим солево-буферным раствором, включающим, г/л: NaCl 6; KCl 0,2; Na₂HPO₄•12H₂O 1,15; KH₂PO₄ 0,2; тринатрийцитрат 2; трипсин 0,05; глюкоза 6; ампициллин 0,2; вода остальное) рН 7,5 при 36,5^oC в течение 1 ч до полного истощения ткани и фильтрованием через маркизетовый фильтр. Далее клетки иммобилизуют на цитодексе, как описано выше.

Заражение клеток производят вирусом КЭ шт. 205 в дозе 0,5 LD₅₀/кл. для взвеси неиммобилизованной культуры и 10 LD₅₀/кл. для иммобилизованных культур соответственно.

Репродукцию вируса в клетках осуществляют при 37^oC в течение 4 сут. При этом неиммобилизованную культуру инкубируют в роллере, а иммобилизированные в спинерной установке.

По окончании стадии репродукции отбирают культуральные взвеси с инфекционной активностью не ниже 7,0 lg LD₅₀/мл, к которым добавляют формалин в концентрации 1:2000 и выдерживают при 32^oC в течение 3 сут при периодическом перемешивании.

Вирусный антиген роллерной культуры выделяют осветлением на сепараторе АСГ-3 с последующим фильтрованием через асбесто-целлюлозные, а затем миллипоровые пластины с размером пор 0,45 мкм.

Вирусный антиген спинерных культур выделяют седиментационной обработкой на рефрижераторной суперцентрифуге Sorvall при 15000 об/мин (фактор разделения 9000), после чего подвергают стерилизующему фильтрованию через миллипоровые пластины с размеров пор 0,22 мкм.

Получение партии вакцины сорбируют на геле гидроокиси алюминия из расчета конечной концентрации адъюванта 1,5 г/л.

В вакцинах определяют содержание общего белка C_б по Лоури и иммуногенную активность по показателю индекса резистентность IR на белых мышах линий Balb/C и СВА массой 14-16 г. В промежуточном продукте вирусной биомассе определяют иммуногенную активность ИА. Результаты контролей по данным 3-6 испытаний приведены в табл. 1.

Как видно из табл.1, в предлагаемом способе, особенно на дезагрегированных ФЭК, существенно снижено количество общего (балластного) белка без снижения иммуногенной активности вакцины.

При контроле бактериологической стерильности полученных вакцин все серии, полученные предлагаемым способом, оказались стерильными, тогда как 33% прототипных серий были нестерильными, что объясняется большим размером пор стерилизующих фильтров в прототипе (уменьшить размер пор в прототипном способе нельзя из-за их забивания клеточным детритом).

Пример 2. Вакцину против КЭ получают из спинерных культур диплоидной линии кожно-мышечной ткани М-22 и дезагрегированных ФЭК, как в примере 1, с использованием различных МН.

В качестве ростовой и поддерживающей сред для культуры М-22 используют среду Игла-МЭМ. Учитывают инфекционную активность вирусной биомассы ИА и IR и C_б вакцины по данным 3-6 параллельных опытов на линейных мышах. Результаты приведены в табл. 2.

Как видно из табл.2, только коллагеновые МН (цитодекс, цитолар, цитопол) с диаметром частиц 160-250 мкм обеспечивают высокие значения инфекционной активности вирусного субстрата и индекса резистентности вакцины. При этом содержание общего белка существенно (по отношению к IR) не возрастает.

Пример 3. Вакцину против КЭ получают при спинерном культивировании вируса в дезагрегированных ФЭК и диплоидных клетках ЛЭЧ, как в примере 1, с использованием различных заражающих доз вируса. При этом для клеток ЛЭЧ в качестве ростовой и поддерживающей сред используют среду Игла-МЭМ. В качестве МН используют цитопол с размером частиц 160-250 мкм. Учитывают инфекционную ИА и антигенную АА (в ИФА) активность вирусной биомассы, а также IR и C_б вакцины по данным 3-6 параллельных опытов. Результаты приведены в табл. 3.

Как видно из таблицы, приемлемым диапазоном заражающих доз является 5-30 LD₅₀/кл. При меньших заражающих дозах недостаточно высокая специфическая активность вирусной биомассы и целевого продукта, а увеличение заражающей дозы на 2-е сутки приводит к развитию острой инфекции и гибели клеточного монослоя.

Пример 4. Вакцины из вирусных субстратов в культурах клеток ФЭК и ЛЭЧ получают, как в примере 3, при различных значениях фактора разделения и заражающей дозе 10 LD₅₀/кл. Помимо C_б учитывают также концентрацию белка после седиментационной обработки С_c. Влияние режимных параметров на характеристики получаемых препаратов проиллюстрировано в табл. 4.

Как видно из таблицы, способ осуществим только в диапазоне фактора разделения от 7000 до 12000. При меньшем значении фактора разделения теряется значительная часть полуфабриката, вплоть до невозможности его дальнейшей обработки. Увеличение данного параметра за верхний предел приводит к потере иммуногенной активности.

Пример 5. Вакцину из вирусного субстрата в культуре дезагрегированных клеток ФЭК получают, как в примере 1. При этом после центрифугирования вируссодержащий материал обрабатывают 0,5 мг/мл протаминсульфата в течение 18 ч при 10^oC. Осадок удаляют с помощью проточного центрифугирования при факторе разделения 9000.

В полученном препарате C_б=178 мкг/мл, IR=6,7 lg LD₅₀.

Введение дополнительной очистки протаминсульфатом уменьшило содержание примесных белков в целевом продукте по сравнению с оптимальным режимом примера 3 в 1,8 раза.

Использование предлагаемого способа обеспечивает по сравнению с прототипом повышение выхода целевого продукта из вирусной биомассы. Как проиллюстрировано примером 4, в оптимальном режиме предлагаемого способа выход составляет 87-89% тогда как в прототипе выход составлял 72-78% (процент выхода в прототипном способе приведен из прилагаемого акта испытания; этот процент в авторских испытаниях, как видно из примера 1, равен 100-33=67%). Кроме того, существенно возросла степень очистки вакцины. Так, в варианте без дополнительной обработки протаминсульфатом содержание белка в полученной предлагаемым способом вакцине (пример 4) составляет 179-407 мнг/мл, тогда как в прототипе это значение было 756±143 мкг/мл.

Изобретение относится к иммунобиотехнологии и может быть использовано при получении культуральных вакцин против клещевого энцефалита. Способ предусматривает заражение вирусом культуры клеток с последующей его репродукцией и инактивированием, выделением, очисткой и сорбцией на адьюванте вирусного антигена. С целью повышения выхода и степени очищенности вакцины культуры клеток иммобилизуют на коллагеновом микроносителе с диаметром частиц 160-250 мкм и заражают дозой вируса клещевого энцефалита 5-30 LD₅₀/кл., а выделение антигена осуществляют седиментационной обработкой при факторе разделения 7000-12000. Для заражения целесообразно использовать диплоидную культуру клеток легкого эмбриона человека или дезагрерованную культуру фибробластов куриных эмбрионов. 2 з. п. ф-лы, 4 табл.

1. Способ получения вакцины против клещевого энцефалита, предусматривающий заражение вирусом культуры клеток с последующей его репродукцией и инактивированием, выделением, очисткой и сорбцией на адъюванте вирусного антигена, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода и степени очистки вакцины, культуру клеток иммобилизуют на коллагеновом микроносителе с диаметром частиц 160 250 мкм и заражают дозой вируса 5 30 LD_5 0/ кл. а выделение антигена осуществляют седиментационной обработкой при факторе разделения 7000 12000. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что заражают дезагрегированную культуру фибропластов куриных эмбрионов. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что заражают диплоидную культуру клеток легкого эмбриона человека.