Способ получения магнитных микроносителей для культивирования клеток эукариот Советский патент 1990 года по МПК C12N5/00 C12N11/02 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к усовершенствованному способу получения магнитных микроносителей (ММН) для культивирования поверхностно-зависимых клеток эукариот, и может найти широкое применение в ветеринарной и медицинской промышленности для выращивания клеток и размножения вирусов на них с целью создания вакцин и сывороток, а

также для получения секретируемых клетками эукариот важных биологически активных веществ, таких как |5- и у -интерфероны, активатор плаз- миногена, гормон роста и др.

Цель изобретения - упрощение способа и улучшение качества целевого продукта за счет увеличения прироста «леток на микроносителях.

Способ заключается в диспергировании магнитного на опителя (МН) на основе оксидов металлов переменной валентности с размером частиц 0,005- 0,05 мкм в растворе желатина, обработке полученной суспензии глутаровым альдегидом и размельчении образующегося геля для получения частиц микроносителя. Последние обрабатывают про- jg теолитическими ферментами до исчезновения шероховатости поверхности. 8 качестве оксидов металлов используют оксиды железа, кобальта и никеля, а соотношение магнитного носителя и желатина устанавливают равным 1:0,5 - 1:10, Использование предлагаемого способа позволяет значительно упростить процесс получения микроносителей за счет исключения стадии дисперсионной конденсации, на которой применяют специальную аппаратуру и органические растворители, а также улучшить качество целевого продукта за счет увеличения прироста клеток в 1,6-2,5 раза.

П р и- м е р 1 . Соли, FeS04-7H20 (35 О и FeClv&H20 (50 г), растворяв 0,15 М растворе NaCl, стерилизую при 120°С и 0,7 ати в течение 20 ми Получают 300 г ММН с содержанием , 8,5 Fe,04. В процессе обработки ММ протеиназами осуществляют визуальн контроль под микроскопом и .обработ ферментами ведут до исчезновения ш ооховатости частиц.

П р v, м е р 2. ММН получают по примеру 1, но на 5,0 г осадка добавляют 200 мл 25 -ного раствора желатина (весовое соотношение МН и желатина 1:10). получают 250 г ММН 15 с содержанием 2% Fe }0Л.

П р и м е р 3. ММН получают по примеру 1, но на 25 г осадк.я Ге304 добавляют 50 мп 5%-ного рдстсора желатина (весовое соотношение МН и желатина .1 :0,5) . Получают 125 г ММ с содержанием 25 e20j.

П р и м е р Ц„ ММН получают по примеру 1, но к 1,1 г осадка Fe304 добавляют 200 мл 25%-ного раствора желатина (весовое соотношение ПН и желатина 1:12), Получают г ММН с содержанием 0,9% .

П р и м е р 5. К25г осадча Fe который

20

25

и промыт по пример о.

ют а 110 мл Н20 каждую, растворы объ

единяют и при перемешивании постелен- 0 ПРИ перемешивании и добавляют

но приливают 100 мл гидрооки200 мл 25 ного раствора желттина аоде (соотношение МН и желатина 1: Полученну суспензию, содержащую ч тицы МН - Ге г04 - с размером 0, ОО З подвергают дальнейшей обработке, д баяляя 55 мп 25 -ного водного раст ра глут ipoBoro альдегида. Далее ве процесс проводят по примеру 1, Пол чают 35U г ММН с содержанием 16,2% .

си аммония. Выпадает тонкодисперсный осадок магнетита Ре30ф, который трижды промывают подкисленной дистиллированной водой. К промытому осадку (25 г) добавляют 00 мл 25%-ного иаствора желатина при 50°С в воде (весовое соотношение МН и желатина 1:1) и при перемешивании до однородной суспензии нагревают в течение 20 мин при 5.0°С. Средний размер частиц магнитного наполнителя 0,005 мкм. К образовавшейся суспензии добавляют 35 мл 253-ного водного раствора глу- тарового альдегида и интенсивно пе- ремеливают в течение 15 мин После выдерживания в течение 15 мин при 20°С блок геля продавливают через сито с диаметром отверстий 200 мкм. Полученные частицы отмывают водой от глутарового альдегида, затем обрабатывают 200 мл 0,25%-ного раствора трипсина в 0,01 М фосфатном буфере (рН 7,6) в течение 3 мин при комнатной температуре и постоянном перемешивании. Для удаления остатков фермента частицы микроносителя промывают 0,01%-ным раствором этилендиамин- тетрауксусной кислоты, суспендируют

g

в 0,15 М растворе NaCl, стерилизуют при 120°С и 0,7 ати в течение 20 мин. Получают 300 г ММН с содержанием 8,5 Fe,04. В процессе обработки ММН протеиназами осуществляют визуальной контроль под микроскопом и .обработку ферментами ведут до исчезновения ше- ооховатости частиц.

П р v, м е р 2. ММН получают по примеру 1, но на 5,0 г осадка добавляют 200 мл 25 -ного раствора желатина (весовое соотношение МН и желатина 1:10). получают 250 г ММН 5 с содержанием 2% Fe }0Л.

П р и м е р 3. ММН получают по примеру 1, но на 25 г осадк.я Ге304 добавляют 50 мп 5%-ного рдстсора желатина (весовое соотношение МН и желатина .1 :0,5) . Получают 125 г ММН с содержанием 25 e20j.

П р и м е р Ц„ ММН получают по примеру 1, но к 1,1 г осадка Fe304 добавляют 200 мл 25%-ного раствора желатина (весовое соотношение ПН и желатина 1:12), Получают г ММН с содержанием 0,9% .

П р и м е р 5. К25г осадча Fe,G4, который

0

5

и промыт по примеру о.

0 ПРИ перемешивании и добавляют

5

0

5

0

5

200 мл 25 ного раствора желттина о аоде (соотношение МН и желатина 1:2) Полученну суспензию, содержащую частицы МН - Ге г04 - с размером 0, ОО З мкм, подвергают дальнейшей обработке, до- баяляя 55 мп 25 -ного водного раствора глут ipoBoro альдегида. Далее весь процесс проводят по примеру 1, Получают 35U г ММН с содержанием 16,2% .

П р и м е р 6. Соли, 5 г FeCi 6Н70 и 2 г СоСЬ-6НгО, растворяют в 50 мл воды каждую, растворы объединяют, нагревают до 90°С и при перемешивании приливают 150 мл 25%-но о оаствора гидроокиси натрия. Перемешивают в течение 10 мин. Обр ззовав- шийся осадок- с размером частиц 0,03 мкм промывают раствором соляной кислоты (0,05 М) до рН 6-8. К промытому осадку добавляют 00 мл 20%-ного раствора желатина в воде (соотношение МН и желатина 1:3), перемешивают до образовании однородной суспензии и нагревают в течение 30 мин при 90°С. Все дальнейшие операции, начиная с добавления 35 мл 25%-ного раствора глутарового альдегида, осуществляют по примеру 1. Получают

00 г ММН с содержанием 6,% феррита кобальта.

Пример. Соли, 51 г Fed, 6Н20 и 20 г NiClj,, растворяют в 50 мл воды каждую, растворы объединяют и нагревают до 90°С. При перемешивании добавляют 150 мл 25%-ного раствора гидроокиси натрия и продолжают перемешивание в течение 0 мин при той же температуре. Образовавшийся осадок (NiFe40.4 с размером частиц 0,05 мкм) промывают раствором 0,05 М соляной кислоть, до рН 6-8. К промытому осадку добавляот АОО мл 20%-ного раствора желатина (соотношение МН и желатина 1:3), перемешивают до образования однородной суспензии и нагревают в течение 30 мин при 90°С Все дальнейшие операции, начиная с добавления 35 мл 25 -ного раствора глутарового альдегида, осуществляют по примеру 1. Получают 10 г микроносителя с содержанием 6,8 феррита никеля.

П р и м е р 8. Процесс осуцествля ют по примеру 1 , но иные частицы после отмывки в 4- и от гяутаровог альдегида обращать аают 0 мл П,20%-н го раствора - синг в Э,01 М фосфатном буфер-, Ч 7,6. Получают 295 г ММН с содержанием Я,5 ,

П р и м э р 3. Го-ihvjib. микроносителя, полученные по призеру 1, помещают в 0,25%-ный раствор юллагрназы в 0,15 М фо-.фатном буфере с рН 7,6 (из ра чр-ta )0 мл раствора фермента из 250 г микроносителя) и выдерживает, перемешивая при комнатной температуре до образования гладкой поверхности гранул, которое фиксируют визуальным наблюдением под микроскопом. Время обработки 3,5 мин. Затем остатки фермента удалит, а продукт промывают по примеру 1.

Оптимальное весовое соотношение МН и желатина 1:(0,). Получение ММН при BtcoLOM соотношении ченее 1: :0,5 затруднитеп-но из-Зй возрастания вязкости раствора, а лри соотношении более 1:10 нецелесообразно, так как приводит к получению с низким содержанием МН (менее 2%), а также к снижению прироста клеток.

Использование частиц h. мемее 0,005 мкм невозможно, так как этот размер имеет однодоменная частица МН5 а более 0,05 мкм нежелательно, так как уменьшается прирост клеток.

,

10

5676236

С целью получения гладкой поверхности магнитного микроносителя, которая необходима для эффективного прикрепления клеток, частицы микроносителя обрабатывают протеолитическими ферментами. Используют трипсин, - химотрипсин и коллагеназу при концентрации 0,2-0,25. В процессе проведения обработки осуществляют .визуальный контроль под микроскопом за поверхностью гранул и обработку ферментом ведут до исчезновения шероховатости поверхности. Это время S составляет обычно 2,,5 мин. Более длительная чЗработка нежелательна, так как при этом разрушаются гранулы м кроносителр, Нежелательно также использование более высоких концентраций ферментов ввиду того, что сокращается впемя обпаботки, что создает сложность в установлении момента окоч аения этой стадии.

20

5 На микроносителях, полученных согласно примерам 1-9, выращивают поверхностно-зависимые клетки почек эмбриона человека перевиваемой линии RH. Культивирование проводят на среде 199, содержащей 3-10% бычьей сыворотки, во флаконах объемом 250 мл с магнитной мешалкой. Клетки высевают, используя на начальном этапе 20% объема (30 мл) питательной среды от конечного. госле засева кпеток сус- периодически перемешивают по 1-2 мич с интервалом 30 мин в течение ч. По окончании процесса прикрепления клеток к микроносителям объем среды доводят до конечного (150 мл), концентрация клеток при этом составляет (,010 кл/мл, и устача пивают постоянный режим работы мешалки - 0 об/мин. Концентрация

микроносителей в конечном объеме среды составляв ; см3 глотного осадка на Ю мл питательно среды, что ot-ч с- печивает площадь около 15 см2 на 1 мл среды. Процесс культивирования

осуществляют при 37 С в течение 7сут. На 3 сут куле ивирования среду заменяют на . По окончании процесса клетки снимают, обрабатывая их 20 мл раствора, содержащего 0,025% трипсина и 0,02% ЗДТА. Количество выросших клетск определяют, подсчитывая их в гемоцитометре после окрашивания три- Пановым синим, Коэффициент прироста клеток рассчитывают по отношению

концентрации выросших клеток к их посевной концентрации.

В таблице приведены сравнительные данные по культивированию перевиваемой линии RH-клеток почек эмбриона человека.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет упростить технологию получения магнитных микроносителей для культивирования клеток эукариот благодаря Исключению стадий дисперсионной поликонденсации и улучшить качество микроносителей за счет увеличения коэффициента прироста клеток на предлагаемых магнитных микроносителях в 1,6-2,5 раза по сравнению с носителями, полученными по известному способу. Кроме того, магнитные микроносители, получаемые предлагаемым способом, содержат заданное количество магнитного носителя, что позволяет использовать их в процессе магнитоуправляемого культивирования.

Формула изобретения

1. Способ получения магнитных микроносителей для культивирования клеток эукариот, включающий смешивание раствора желатина с магнитным наполнителем из оксидов металлов переменной валентности, получение частиц Микроносителя с проведением обработки желатина глутаровым альдегидом, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и улучшения качества целевого продукта за счет увеличения прироста клеток на микроносителях, в качестве магнитного наполнителя используют частицы оксидов ме- таллов переменной валентности размером 0,005-0,05 мкм, обработку желати

5

на глутаровым альдегидом проводят пе- пед получением частиц микроносителя, а частицы микроносителя получают размельчением геля с последующей обработкой их протеолитическими ферментами до исчезновения шероховатости поверхности.

2.Способ по п.1, отличающий с я тем, что соотношение магнитный наполнитель и желатин устанавливают равным 1:0,5-1:10.

3.Способ поп.1, отли ча ю - щ и и с я тем, что в качестве оксидов металлов переменной валентности используют оксиды железа, кобальта или никеля.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к усовершенствованному способу получения магнитных микроносителей для культивирования клеток эукариот. Целью изобретения является упрощение способа и улучшение качества целевого продукта за счет увеличения прироста клеток на микроносителях. Способ заключается в обработке раствора желатина поперечно-сшивающим агентом - глутаровым альдегидом, размельчении блок-полимера с целью получения частиц определенного размера и обработке полученных частиц протеолитическим ферментом. При этом предварительно проводят введение в раствор желатина частиц магнитного наполнителя размером 0,005 - 0,05 мкм (оксидов металлов переменной валентности) в соотношении магнитный наполнитель - желатин 1:(0,5 - 10). На полученных таким способом микроносителях прирост клеток перевиваемой линии RH повышается в 1,6 - 2,5 раза по сравнению с микроносителями, полученными по известному способу. Упрощение способа достигается за счет исключения стадии дисперсионной конденсации. 2 з.п. ф-лы, 1 табл.