Способ определения физиологического состояния бактериальных клеток ЕSснеRIснIа coLI в препарате Советский патент 1987 года по МПК C12Q1/02 

Изобретение относится к практической и экспериментальной микробиологии, в частности к способу определения жизнеспособности и устойчивости биопрепаратов к стрессовым воздействиям,

Цель изобретения - упрощение способа и сокращение времени определения.

Способ осуществляется путем микро скопирования в фаэовом контрасте высушенных бактериальных клеток E.coli в препарате. Для этого на чистое покровное стекло наносят 2-5 мкл 0,01 - 0,05%-ного раствора тетрабората натрия, который, являясь эмульгатором, препятствует агрегированию клеток. Затем сюда же вносят 1-10 нл иссле- дуемого биопрепарата и, тщательно перемешав, дают суспензии высохнуть. Количество материала выбирают таким образом, чтобы пятно слегка опалесци ровало, а на просвет было прозрачным. Полученный таким образом препарат укрепляют на предметном стекле с помощью смазки, следя за TQM, чтобы пятно оставалось,сухим, и микро- скопируют указанным способом.

В поле зрения микроскопа можно наблюдать три типа клеток, которые характеризуются строго определенными морфологическими и связанными с ними светооптическими характеристиками. Пользуются оптическими признаками, подразумевая взаимно однозначное соответствие морфологическим признакам клетки.

Тип L. Оптически пустые клетки округлой формы. Хорошо видна оболочка, но структурные элементы внутри микроорганизма отсутствуют.

Тип G. Клетки с оптической структурой вытянутой (овальной) формы. Внутри хорошо различимой оболочки имеют место структурные элементы, например, полюса.

Тип S. Оптически-плотные (темные) клетки вытянутой формы.Структурные элементы едва различимы.

С помощью окулярной сетки определяют абсолютное, а затем и относительное содержание в препарате клеток с рассмотренными признаками.

Ведение анализа сухих бактериальных препаратов позволяет сократить время определения жизнеспособности до 3-5 мин с погрешностью, не превышающей 2%, с одновременным определением устойчивости микробной популяции к стрессовым воздействиям.

Использование предлагаемого способа позволяет дополнительно определить устойчивость микробной популяг ции к стрессовым воздействиям и существенно (до 3-5 мин, или в 400 - 500 раз) уменьщить время анализа био0 препарата.

Пример 1. На покровное стекло наносят 2 мкл 0,05%-ного раствора тетрабората натрия и сюда же-вносят 2 нл исследуемой культуры E.coli с

5 жизнеспособностью по данным биологического контроля 57%. Препарату дают высохнуть, укрепляют на предметном стекле и микроскопируют в фазовом контрасте с объективом 70х-и окуляQ -ром 0х. В препарате определяют относительное содержание клеток с определенными оптическими характеристиками: L-тип 43%, G-тип 40%, S- тип 8%. Жизнеспособность исследуемо5 го биопрепарата: G + S 57% определяется суммарным содержанием клеток G- и S-типа i .

П р и м е р 2. Препарат готовят и микроскопируют аналогично примеру

0 1. По данным биоконтроля высушенный образец характеризуется жизнеспособ ностью 14%. В поле зрения микроскопа определяют относительное содержание клеток с определенными оптическими характеристиками: L-тип 34%, G-тип 52%, S-тип 14%. Устойчивость пpeпapa та к высушиванию 14% определяется co-v держанием клеток S-типа.

П р и м е р 3. Препара т лиофили- зированной культуры готовят и микроскопируют аналогично примеру 1. По данным биологического контроля бактериальный препарат характеризуется жизнеспособностью 7%, Затраты времё5 ни, необходимого для проведения анализа, около 28 ч. В поле зрения микроскопа определяют .относительное содержание клеток с определенными оптическими признаками: L-тип 53%,

0 G-тип 40%, S-тйп 7%. Устойчивость препарата к высушиванию 7% определяется содержанием клеток S-типа. Затраты времени 5-6 мин. ,

В табл.1 представлены результаты

5 определения жизнеспособности и устой-- чивости к высушиванию различных.бактериальных препаратов E.coli. Микро- культуральный метод показал, .что относительное содержание клеток, обра5

0

зовавших колонии до высушивания препарата, составляет соответственно 70 и 22% для штамма E.coli М-17 и 90 и 95% для штамма К-12.

Определение относительного содержания клеток G- и S-типов показывает, что суммарное их количество 71, 22% для E.coli М-17 и 91, 94% для E.coli К-12 соответствует значениям жизне.способности, определенным микро- культуральным методом. С другой стороны, высушенные различными способа-: ми бактериальные препараты характеризуются пониженной жизнеспособностью, которая по данным биологического контроля составляет 5 и 19% для E.coli М-17 и 0% для штамма К-12. Морфологический анализ позволяет определить, что содержание клеток S-типа составляет соответственно 4,19 и 0%, следовательно, присутствие клеток S-типа характеризует жизнеспособност микробной популяции после стресса, т.е. ее устойчивость к высушиванию.

Приводим результаты хронометрирования предлагаемого способа по сравнению с известным. Известный микрокуль туральный метод при условии наличия необходимых веществ химической чистоты предусматривает следующие операции: приготовление питательной среды и нанесение ее тонкой пленкой на предметное стекло 2,5 ч, нанесение на питательную подложку исследуемой культуры, подсушивание и герметизация покровным стеклом 0,5ч, 1-е микроскопирование препарата 0,1ч, инкубирование в течение 16-24 ч при , 2-е микроскопирование с определением числа микроколоний 0,1ч.

Согласно предлагаемому способу проводят следующие операции: приготовлени

раствора тетраборатанатрия 1 мин; при- g светооптическим характеристикам и

готовление препарата 2 мин; микроскопи- рование 3-8 мин. Общие за траты времени составляют 6 мин. Таким образом,предлагаемый способ обеспечивает повьш1е- ние эффективности микробиологических

50

по содержанию оптически плотных и структурированных клеток оценивают их жизнеспособность, а по содержан оптически плотных клеток - устойчи вость к стрессовым воздействиям.

5

работ приблизительно в 300 раз (272 раза). Необходимо отметить, что предлагаемый способ позволяет исследовать на одном покровном стекле до 9-16 препаратов, следовательно,суммарная эффективность может быть повышена еще примерно вдвое, т.е. доведена до уровня 400-500 раз.

Зависимость результатов микрокуль- турального метода определения жизнеспособности биопрепарата от содержания клеток G- и Зттипов представлена на фиг.1. Аналогичная зависимость для высушенных образцов и содержания клеток S-типа представлена на фиг,2. Содержание в препарате клеток G- и Б-ТИПОВ определяет жизнеспособность микробной популяции, а содержание клеток S-типа - ее устойчивость к стрессовому воздействию. В таблице представлены результаты исследования

различных биопрепаратов.

I

Применение предлагаемого способа определения физиологического состоя- ния бактериальных клеток позволяет по .сравнению существенно упростить анализ биопрепарата и уменьшить (в 400-500 раз) время определения жизнеспособности и устойчивости микробных клеток к стрессовым воздействиям.

Формула изобретения

Способ определения физиологического состояния бактериальных клеток Escherichia coli в препарате путем микроскопирования, отличаю- 0 щ и и с я , тем, что, с целью упрощения способа и сокращения времени определения, в процессе микроскопирования осуществляют дифференциацшо микроорганизмов в препарате,по их

0

5

0

5

по содержанию оптически плотных и структурированных клеток оценивают, их жизнеспособность, а по содержанию оптически плотных клеток - устойчивость к стрессовым воздействиям.

JO

HOE ,%

Редактор С.Патрушева

Составитель Л.Борисова Техред А.Кравчук

Заказ 3453/29Тираж 499Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Производственно-прлиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул.Проектная, 4

10

20

за

.г

Корректор И. Муска

Изобретение относится к области практической и экспериментальной микробиологии. Целью изобретения является упрощение способа и сокращение времени определения. Способ заключается в том, что дифференцируют бактериальные клетки в высушенном препарате Escherichia coli по их светоопти- ческим характеристикам и по содержанию оптически плотных и структурированных клеток судят о жизнеспособности, а по содержаниюоптически плотных клеток - об устойчивости к стрессовым воздействиям. 1 табл., 2 ил. W СА N5 00 СдР vj