Изобретение относится к способам исследования микробиологических объектов биофизическими методами, в частности к способам определения количества живых микробов, и может быть использовано при производстве биопрепаратов профилактического, лечебного и народно-хозяйственного назначения, содержащих живые микроорганизмы.
Известен способ определения количества живых микроорганизмов, заключающийся в высеве микробных суспензий на плотные питательные среды [1] Способ позволяет выявлять живые микробные клетки по их способности размножаться и образовывать колонии на питательной среде. При этом считается, что каждая колония является результатом размножения одной клетки. Этот способ включает в себя следующие операции:
приготовление из исследуемой суспензии необходимого количества десятичных разведений в пробирках;
высев из конечного разведения определенного объема исследуемой суспензии на плотную (агаризированную) питательную среду в чашки Петри;
термостатирование чашек с засеянными средами при температуре, благоприятной для развития выявляемых микроорганизмов;
подсчет выросших на чашках колоний;
определение количества живых микроорганизмов в единице объема исходной суспензии.
Общим с предлагаемым способом является этап приготовления из суспензии предварительного разведения необходимой кратности.
К недостаткам данного способа следует отнести низкую точность и плохую воспроизводимость результатов определений числа живых бактерий. Источником ошибок являются следующие:
неравномерное распределение клеток во взвеси и на плотной питательной среде, адсорбция микроорганизмов поверхностью стекла пипеток;
зависимость результатов анализа от качества питательной среды и условий культивирования.
Серьезными практическими недостатками этого способа являются его трудоемкость и длительность. Проведение анализа требует значительного расхода стерильной посуды разового использования, агаризованной питательной среды и разводящей жидкости, а также создания оптимальных для развития микроорганизмов условий выращивания (температуры, влажности, освещенности и т.д.). Подсчет выросших колоний можно производить не ранее чем через 1-3 дня после посева.
Также известен способ определения количества живых микроорганизмов, использующий циторефрактометрический анализ микробных суспензий [2] Он позволяет дифференцировать живые и мертвые микроорганизмы по показателю преломления их протоплазмы. Этот способ включает в себя следующие операции:
разведение исследуемой суспензии до необходимой концентрации по стандарту мутности;
подсчет общего количества (живых и мертвых) клеток под микроскопом с помощью счетной камеры Тома-Горяева;
приготовление препарата микроорганизмов для аноптральной микроскопии и подсчет оптически пустых (живых) и светящихся (мертвых) клеток в препарате;
расчет процентного содержания оптически пустых (живых) клеток в препарате;
определение количества живых микроорганизмов.
Общим с предлагаемым способом является этап приготовления предварительного разведения до необходимой концентрации клеток во взвеси.
К недостаткам данного способа следует отнести длительность и трудоемкость определения общего количества клеток в исследуемой суспензии. Для этого необходимо просмотреть не менее 5 полей зрения с подсчетом в каждом из них не менее 300 клеток. Микроскопически малые размеры микробных тел затрудняют процедуру распознавания и подсчета их в препарате среди инородных частиц и артефактов. Указанные трудности при определении общего количества клеток в суспензии, в свою очередь, снижают точность и воспроизводимость способа в целом.
Источником возможных ошибок может быть наличие в препарате переходных форм микробных клеток, которые не являются полностью оптически пустыми и имеют в протоплазме различного размера святящиеся участки. Отнесение таких клеток к живым или мертвым связано с большими трудностями и требуют от оператора высокой специальной подготовки.
В качестве прототипа выбран способ определения количества живых микроорганизмов, основанный на фотометрическом анализе бактериальных взвесей [3] Способ включает следующие этапы:
разведение исследуемой суспензии в осмотически активных средах до такой концентрации, чтобы оптическая плотность взвесей микробов в гипо- и гипертонической среде находилась в пределах наибольшей чувствительности фотометра;
измерение величины ослабления интенсивности падающего света (оптической плотности, экстинкции, Е) взвесью микробов, суспендированных в гипо- и гипертонческой средах;
расчет величины прироста оптической плотности взвеси микробов в гипертонической среде относительно ее значений в гипотонической среде;
определяют содержание живых микробов по калибровочному графику зависимости величины прироста оптической плотности бактериальной суспензии от соотношения в ней живых и мертвых клеток.
В качестве среды с высоким осмотическим давлением в способе прототипа используют 0,6М (3,5%) раствор хлористого натрия. Эта среда является гипертонической по отношению к цитоплазме живых микробов и вызывает их плазмолиз (уменьшение объема протопласта клеток вследствие выхода внутриклеточной воды ). При этом светорассеяние взвеси микробов возрастает. Мертвые клетки в гипертоническом растворе хлористого натиря не плазмолизируются и светорассеяние взвеси не меняют. В качестве среды с низким осмотическим давлением используют дистиллированную воду. По разности мутности взвеси микробов в гипер- и гипотонической средах, отнесенной к исходной мутности взвеси в дистиллированной воде, рассчитывают величину осмооптического или турбидиметрического эффекта бактериальной суспензии (формула 1)
Тэ (Eв Ен)/Ен (1) где Тэ турбидиметрический эффект микробной суспензии, ед. экст.
Ев, Ен оптическая плотность (экстинкция) взвеси микробов в 0,6 М (3,5%) растворе хлористого натрия и дистиллированной воде, ед. экст.
Содержание живых микробов определяют по калибровочному графику зависимости величины Тэ от соотношения живых и мертвых клеток в бактериальной суспензии.
Общими с предлагаемым изобретением являются следующие этапы:
разведение исследуемой суспензии в осмотически активных средах;
измерение оптической плотности взвеси микробов, суспендированных в осмотически активных средах;
расчет по значениям оптической плотности взвесей микробов в осмотически активных средах характеристик абсолютного и относительного прироста оптической плотности, называемого осмооптическим эффектом (ООЗ) исследуемой суспензии;
определение по характеристикам ООЗ количества живых микробов.
К недостаткам рассматриваемого способа следует отнести низкую точность и воспроизводимость результатов определений количества живых микробов в нативных культурах и биопрепаратах. Это связано с малой величиной и нестабильностью регистрируемого осмооптического эффекта в бактериальных суспензиях.
Кроме того, способ не дает информацию об абсолютной концентрации живых микробов в биопрепарате.
Задачей изобретения является повышение точности и воспроизводимости определения числа живых микробов.
Поставленная задача решается благодаря тому, что в способе определения содержания живых микробов в биопрепарате, включающем разведение биопрепарата, измерение оптической плотности полученной взвеси микробов в средах с различным осмотическим давлением, расчет показателей ООЗ бактериальной взвеси и определение по их значениям количества живых микробов, предусмотрены следующие отличия:
градиент осмотического давления создают в гипертонической и "изотонической" по отношению к цитоплазме микробов средах, имеющих одинаковые показатель преломления света и концентрацию водородных ионов;
в качестве "изотонической" по отношению к цитоплазме микробов среды используют раствор индифферентного соединения неэлектролита;
в качестве гипертоничесой среды с высоким осмотическим давлением используют раствор хлористого натрия в концентрации, при которой оптическая плотность взвеси исследуемого вида микроорганизма является наибольшей;
величина абсолютной концентрации живых микробов приводится в однозначную зависимость от величины показателей абсолютного и относительного прироста оптической плотности взвеси микробов в градиенте осмотического давления.
Указанные отличия обусловлены следующими причинами:
оптический отклик плазмолизированных бактерий, его максимальное значение и стабильность проявления определяет не только величина осмотической нагрузки гипертонического раствора, но и уровень осмотического давления раствора-эталона, относительно которого рассчитывают прирост оптической плотности микробной взвеси: если гипертонический раствор для достижения наибольшей оптической плотности микробной взвеси должен вызвать полный плазмолиз бактерий, то раствор-эталон должен обеспечить условия, при которых микробная оболочка не будет испытывать механической нагрузки. Это возможно, когда между протопластом клетки и окружающей средой имеет место осмотическое равновесие. Именно изотоничность раствора-эталона, обеспечивающая постоянство объема живой и мертвой клетки, позволяет избежать существенных различий в светорассеянии взвесей живых и мертвых бактерий;
необходимость обеспечения изотоничных условий в растворе-эталоне не только для живых, но и для мертвых клеток с нарушенной проницаемостью микробной оболочки требует использовать раствор вещества, осмотический барьер к которому не меняется и после гибели бактерии;
раствор-эталон не должен быть токсичным для живых бактерий и активным участником их метаболизма, что могло бы изменить рефрактометрические характеристики исследуемых микробных клеток в течение всего времени, необходимого для измерения оптической плотности бактериальной суспензии;
оптическую плотность бактериальных суспензий, как грубодисперсных систем, определяет не только число микробных тел в единице объема, но и соотношение значений показателя преломления дисперсной фазы (клеток) и дисперсионной среды (суспендирующего раствора), что требует внесения поправок при измерении величины оптической плотности взвеси микробов в средах с высоким и низким осмотическим давлением;
оптическая плотность взвеси микробов, способных в зависимости от условий регулировать внутриклеточное осмотическое давление, зависит от концентрации водородных ионов в межклеточной среде;
величина абсолютного прироста оптической плотности взвеси микробов в градиенте осмотического давления пропорциональна абсолютной концентрации в ней живых бактерий;
величина относительного прироста оптической плотности взвеси микробов в градиенте осмотического давления отражает плазмолитическую способность клеток бактериальной суспензии и определяет величину коэффициента пропорциональности между величиной абсолютного прироста оптической плотности взвеси микробов в осмотическом градиенте и содержанием в ней жизнеспособных микробов.
Способ включает следующие этапы:
разведение исследуемой суспензии;
измерение оптической плотности взвеси микробов в средах с высоким и низким осмотическим давлением;
определение по результатам измерения оптической плотности осмооптических характеристик плазмолитической реакции бактерий;
расчет по характеристикам плазмолитической реакции клеток абсолютной концентрации живых микробов.
Способ выполняется следующим образом.
Исследуемую бактериальную суспензию разводят дважды. Первый раз предварительное разведение в физиологической для данного вида микроорганизма среде. Второй раз стандартное разведение в осмотически активных растворах. Кратность предварительного разведения подбирают так, чтобы значение экстинкции взвеси микробов после стандартного разведения в осмотически активных средах находилась в пределах наибольшей чувствительности измерительного прибора. Выбрав кратность предварительного разведения, исследуемую пробу разводят параллельно в трех мерных колбах 0,85%-ным раствором хлористого натрия. Для этого мерную колбу вместимостью, соответствующей выбранной кратности разведения, заполняют на 2/3 указанным раствором и вносят в нее расчетное количество исследуемой микробной культуры. Содержимое колбы тщательно перемешиают физиологическим раствором, доводят его объем до метки. Колбу закрывают резиновой пробкой и повторно перемешивают.
Градуированной пипеткой на 1,0 см3 отбирают из средней части первой колбы по (1,00 ± 0,05) см3 разведенной пробы и переносят ее в две пробирки с гипертоническим раствором хлористого натрия (7,3% ) и две пробирки с "изотоническим" раствором сахарозы (8,4%). Объем осмотически активных сред в пробирках должен составлять 4,0 см3 (в каждой). То же самое проделывают со второй и третьей колбами. Таким образом подготавливают для каждой исследуемой микробной культуры три ряда пробирок, содержащих по две параллельные пробирки каждого раствора. Пробирки закрывают ватно-марлевыми пробками и тщательно перемешивают.
Измеряют экстинкцию полученных взвесей микробов в осмотически активных растворах на фотоэлектроколориметре в кювете с длиной оптического пути 10,0 мм при светофильтре с длиной волны (0,540±0,01) мкм. В качестве сравнительной пробы используют дистиллированную воду. Измерения проводят не позднее 15 мин с момента приготовления разводок в пробирках с сахарозой и хлористым натрием. Предварительное разведение осуществляют экспериментальным путем непосредственно перед проведением основного анализа.
По оптической плотности взвесей микробов в гипер- и "изотоническом" растворах определяют характеристики плазмолитической реакции бактерий. Величины показателя абсолютного прироста оптической плотности (Δ Е) рассчитывают по разности двух значений экстинкции, одно из которых соответствует оптической плотности взвеси микробов в гипертоническом растворе (Ег), другое оптической плотности взвеси микробов в "изотоническом" растворе (Еи) (формула 2).
Δ Е (Ег Еи) (2)
Величину показателя, характеризующего относительный прирост оптической плотности (р), рассчитывают из отношения Δ Е к оптической плотности взвеси в "изотоническом" растворе (формула 3)
Р Δ Е/Еи (3)
По результатам определения абсолютного и относительного показателей ООЗ бактериальной суспензии рассчитывают абсолютную концентрацию в ней жизнеспособных микробов.
БКф f(Δ Е, Р) (4)
Наличие причинно-следственной связи между совокупностью существенных признаков заявляемого объекта и достигаемым техническим результатом показано в табл.1.
Предлагаемый способ определения числа живых микробов в бактериальных суспензиях и биопрепаратах имеет следующие преимущества:
дает информацию об абсолютной концентрации жизнеспособных микробов на основных этапах приготовления бактериальных препаратов;
имеет достаточную для практического применения точность и воспроизводимость. Его ошибка не превышает 11% а расхождение результатов анализа между лабораториями 16% Пороговое значение ООЗ, которое гарантирует его измерение на отечественных КФК с погрешностью в пределах 4% составляет 0,02 ед. экст. что соответствует примерно (0,5.1,0) млрд. живых клеток в см3.
По своим эксплуатационным характеристикам способ отвечает требованиям, предъявляемым к методам инструментального контроля в современном микробиологическом производстве. Для проведения анализа не требутся сложного оборудования, специальной подготовки. Выполнение его доступно лаборантам, владеющим традиционными приемами микробиологической практики. Затраты времени на исследования одной пробы с момента ее поступления в лабораторию не превышает 10 мин, что позволяет характеризовать предлагаемый метод как экспрессный. Трудозатраты на анализ одной пробы составляют 0,25 чел x ч.
Простота измерений ООЗ позволяет автоматизировать процедуру осмооптического определения числа живых микробов.
П р и м е р 1. Определение содержания живых микробов в вакцине чумной живой сухой.
Регидратированный препарат вакцины чумной живой сухой разводят параллельно в трех мерных колбах 0,85%-ным раствором хлористого натрия в 25 раз. Для этого мерную колбу вместимостью 25 см3 заполняют на 2/3 указанным раствором и вносят в нее 1 см3 исследуемой микробной культуры. Содержимое колбы тщательно перемешивают физиологическим раствором, доводят его объем до метки. Колбу закрывают резиновой пробкой и повторно перемешивают.
Градуированной пипеткой на 1,0 см3 отбирают из средней части первой колбы по (1,00 ± 0,05) см3 разведенной пробы и переносят ее в две пробирки с гипертоническим раствором хлористого натрия (7,3% ) и две пробирки с "изотоническим" раствором сахарозы (8,4%). Объем осмотически активных сред в пробирках должен составлять 4,0 см3 (в каждой). То же самое проделывают со второй и третьей колбами. Таким образом подготавливают для каждой исследуемой микробной культуры три ряда пробирок, содержащих по две параллельных пробирки каждого раствора. Пробирки закрывают ватно-марлевыми пробками и тщательно перемешивают.
Измеряют экстинкцию полученных взвесей микробов в осмотически активных растворах на фотоэлектроколориметре в кювете с длиной оптического пути 10,0 мм при светофильтре с длиной волны (0,540±0,01) мкм. В качестве сравнительной пробы используют дистиллированную воду. Измерения проводят не позднее 15 мин с момента приготовления разводок в пробирках с сахарозой и хлористым натрием.
Для бактериальных препаратов на основе микробов Y.pestis штамма ЕВ формула расчета абсолютной концентрации живых бактерий имеет следующий вид:
БК (3,01 x Р + 2,49) x Δ Е x с, (5) где БК концентрация осмотически активных (способных к плазмолизу в гипертоническом растворе хлористого натрия) живых микробов, млрд. живых клеток в см3.
с общая кратность разведения.
Установленные зависимости и их аналитические выражения справедливы при значениях Р для бактериальных суспензий Y.pestis штамма ЕВ от 0,1 до 0,5.
П р и м е р 2. Определение содержания живых микробов в вакцине туляремийной живой сухой.
Регидратированный препарат вакцины туляремийной живой сухой разводят параллельно в трех мерных колбах 0,85%-ным раствором хлористого натрия в 10 раз. Для этого мерную колбу вместимостью 25 см3 заполняют на 2/3 указанным раствором и вносят в нее 2,5 см3 исследуемой микробной культуры. Содержимое колбы тщательно перемешивают физиологическим раствором, доводят его объем до метки. Колбу закрывают резиновой пробкой и повторно перемешивают.
Градуированной пипеткой на 1,0 см3 отбирают из средней части первой колбы по (1,00 ± 0,05) см3 разведенной пробы и переносят ее в две пробирки с гипертоническим раствором хлористого натрия (7,3% ) и две пробирки с "изотоническим" раствором сахарозы (8,4%). Объем осмотически активных сред в пробирках должен составлять 4,0 см3 (в каждой). То же самое проделывают со второй и третьей колбами. Таким образом подготавливают для каждой исследуемой микробной культуры три ряда пробирок, содержащих по две параллельные пробирки каждого раствора. Пробирки закрывают ватно-марлевыми пробками и тщательно перемешивают.
Измеряют экстинкцию полученных взвесей микробов в осмотически активных растворах на фотоэлектроколориметре в кювете с длиной оптического пути 10,0 мм при светофильтре с длиной волны (0,540±0,01) мкм. В качестве сравнительной пробы используют дистиллированную воду. Измерения проводят не позднее 15 мин с момента приготовления разводок в пробирка с сахарозой и хлористым натрием.
Для бактериальных препаратов на основе микробов, F.tularensis формула расчета абсолютной концентрации живых бактерий имеет следующий вид:
БК (0,70 x P + 7,80) xΔ E x с, (6) где БК концентрация осмотически активных (способных к плазмолизу в гипертоническом растворе хлористого натрия) живых микробов, млрд. живых клеток в см3;
с общая кратность разведения.
Установленные зависимости и их аналитические выражения справедливы при значениях Р для бактериальных суспензий F.tularensis от 0,16 до 0,51.
П р и м е р 3. Определение содержания живых микробов в культуре S.enteritidis.
Исследуемую микробную культуру S.enteritidis разводят параллельно в трех мерных колбах 0,85%-ным раствором хлористого натрия в 10 раз. Для этого мерную колбу вместимостью 50 см3 заполняют на 2/3 указанным раствором и вносят в нее 5 см3 исследуемой микробной культуры. Содержимое колбы тщательно перемешивают физиологическим раствором доводят его объем до метки. Колбу закрывают резиновой пробкой и повторно перемешивают.
Градуированной пипеткой на 1,0 см3 отбирают из средней части первой колбы по (1,00 ± 0,05) см3 разведенной пробы и переносят ее в две пробирки с гипертоническим раствором хлористого натрия (7,3% ) и две пробирки с "изотоническим" раствором сахарозы (8,4%). Объем осмотически активных сред в пробирках должен составлять 4,0 см3 (в каждой). То же самое проделывают со второй и третьей колбами. Таким образом подготавливают для каждой исследуемой микробной культуры три ряда пробирок, содержащих по две параллельные пробирки каждого раствора. Пробирки закрывают ватно-марлевыми пробками и тщательно перемешивают.
Измеряют экстинкцию полученных взвесей микробов в осмотически активных растворах на фотоэлектроколориметре в кювете с длиной оптического пути 10,0 мм при светофильтре с длиной волны (0,540±0,01) мкм. В качестве сравнительной пробы используют дистиллированную воду. Измерения проводят не позднее 15 мин с момента приготовления разводок в пробирках с сахарозой и хлористым натрием.
Для бактериальных культур на основе микробов S.enteritidis var. Danysz формула расчета абсолютной концентрации живых бактерий имеет следующий вид:
для микроба S.entеritidis
БК (0,90 x Р + 3,33) x Δ E x c (7) где БК концентрация осмотически активных (способных к плазмолизу в гипертоническом растворе хлористого натрия) живых микробов, млрд. живых клеток в см3;
с общая кратность разведения.
Установленные зависимости и их аналитические выражения справедливы при значениях Р для бактериальных суспензий S.enteritidis от 0,17 до 0,50.
П р и м е р 4. Определение содержания живых микробов в культуре Ps.mallei.
Микробную культуру Ps.mallei готовят к анализу по методике, представленной в примере 3.
Для бактериальных культур на основе микробов Ps.mallei формула расчета абсолютной концентрации живых бактерий имеет следующий вид:
БК (3,64 x P + 1,61) x Δ Е x с (8) где БК концентрация осмотически активных (способных к плазмолизу в гипертоническом растворе хлористого натрия) живых микробов, млрд. живых клеток в см3;
с общая кратность разведения.
Установленные зависимости и их аналитические выражения справедливы при значениях Р для бактериальных культур P.mallei от 0,08 до 0,57.
П р и м е р 5. Определение содержания живых микробов в сухом препарате колибактерине.
Регидратированный препарат колибактерина разводят параллельно в трех мерных колбах 0,85%-ным раствором хлористого натрия в 5 раз. Для этого мерную колбу вместимостью 25 см3 заполняют на 2/3 указанным раствором и вносят в нее 5,0 см3 исследуемой микробной культуры. Содержимое колбы тщательно перемешивают физиологическим раствором, доводят его объем до метки. Колбу закрывают резиновой пробкой и повторно перемешивают.
Градуированной пипеткой на 1,0 см3 отбирают из средней части первой колбы по (1,00 ± 0,05) см3 разведенной пробы и переносят ее в две пробирки с гипертоническим раствором хлористого натрия (7,3% ) и две пробирки с "изотоническим" раствором сахарозы (8,4%). Объем осмотически активных сред в пробирках должен составлять 4,0 см3 (в каждой). То же самое проделывают со второй и третьей колбами. Таким образом подготавливают для каждой исследуемой микробной культуры три ряда пробирок, содержащих по две параллельных пробирки каждого раствора. Пробирки закрывают ватно-марлевыми пробками и тщательно перемешивают.
Измеряют экстинкцию полученных взвесей микробов в осмотически активных растворах на фотоэлекроколориметре в кювете с длиной оптического пути 10,0 мм при светофильтре с длиной волны (0,540±0,01) мкм. В качестве сравнительной пробы используют дистиллированную воду. Измерения проводят не позднее 15 мин с момента приготовления разводок в пробирках с сахарозой и хлористым натрием.
Для бактериальных препаратов на основе микробов Е.coli M17 формула расчета абсолютной концентрации живых бактерий имеет следующий вид:
БК 2,8 x Δ Е x с (9) где БК концентрация осмотически активных (способных к плазмолизу в гипертоническом растворе хлористого натрия) живых микробов, млрд. живых клеток в см3;
с общая кратность разведения.
В табл.2 представлены результаты оценки сходимости значений концентрации живых микробов в микробных суспензиях при определении методом высевом на питательные среды и предлагаемым методом по величине относительной ошибки tс. Последнюю рассчитывали по каждой из исследованных серий препаратов по формуле
tc I (БКч БКф)/(Sч + Sф) I, (10)
где tc относительная ошибка (коэффициент Стьюдента), отн. ед.
БКч, БКФ среднее арифметическое значение концентрации живых микробов, определенное высевом на питательные среды и предлагаеым способом соответственно, млрд. живых микробов в см3;
Sч, Sф среднее квадратическое отклонение отдельного результата при определении высевом на питательные среды и предлагаемым способом соответственно, млрд. живых микробов в см3.
Достаточно низкие средние значения статистики tс указывают, что различия между данными высева на питательные среды и определениями предлагаемым способом на фоне ошибок этих методов незначимы. Это свидетельствует об удовлетворительной сходимости результатов предлагаемого способа определения концентрации живых микробов с данными высева на питательных средах.
Использование: изобретение относится к способам исследования микробиологических обьектов биофизическими методами, в частности к способам определения количества живых микробов, и может быть использовано при производстве биопрепаратов профилактического, лечебного и народно-хозяйственного назначения, содержащих живые микроорганизмы. Сущность изобретения: способ заключается в том, что оптический отклик живых микробов регистрируется в градиенте осмотического давления, создаваемого гипертонической и "изотонической" по отношению к цитоплазме микроорганизмов средами, имеющими одинаковые показатель преломления света и концентрацию водородных ионов. В качестве гипертонической среды используется раствор хлористого натрия в концентрации, при которой оптическая плотность взвеси исследуемого вида микроба является наибольшей, а в качестве "изотонической" - раствор индифферентного соединения (неэлектролита) в концентрации, близкой к внутриклеточному осмотическому давлению бактерий. Для расчета числа живых клеток используются абсолютный и относительный показатели осмооптического отклика микробных взвесей. Это позволяет определить содержание в препарате жизнеспособных бактерий с учетом их плазмолитической способности. Способ дает информацию об абсолютной концентрации жизнеспособных микробов на основных этапах приготовления бактериальных препаратов и обеспечивает достаточные для практического применения точность и воспроизводимость. 3 з.п. ф-лы, 2 табл.
| Переносная печь для варки пищи и отопления в окопах, походных помещениях и т.п. | 1921 |
|
SU3A1 |
| Микробиология, эпидемиология и иммунология, N 4, 1966, с.130-134. | |||
